基于表位預(yù)測的抗B型肉毒毒素基因工程抗體的研究.pdf

1、肉毒神經(jīng)毒素是由肉毒梭菌產(chǎn)生的目前已知毒力最強(qiáng)的毒素蛋白。成熟的毒素分子是由二硫鍵連接的重鏈與輕鏈組成?，F(xiàn)有的研究證明BoNT的重鏈可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有保護(hù)作用的中和抗體，但其抗原表位的定位尚不清楚，本研究的目的即通過生物信息學(xué)手段進(jìn)行表位預(yù)測，嘗試建立基于表位預(yù)測的快速獲得針對表位肽的特異性抗體的技術(shù)路線，為抗B型肉毒毒素基因工程抗體的研究提供新的思路。 本研究首先應(yīng)用生物信息學(xué)手段，根據(jù)B型肉毒毒素重鏈的一級結(jié)構(gòu)，利用ANTH

2、WINE，Ooldkey等分析軟件，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，綜合參考親水性，可及性，柔韌性，及二級結(jié)構(gòu)等多種參數(shù)預(yù)測合成了8條表位肽序列，體內(nèi)外的免疫學(xué)試驗證明8條表位肽均具有免疫原性及免疫反應(yīng)性，是很好的免疫原，表位肽免疫的小鼠可不同程度抵御毒素分子的攻擊。 在表位預(yù)測的基礎(chǔ)上，利用噬菌體展示技術(shù)，以表位肽為免疫原，免疫BALB／C小鼠，取脾淋巴細(xì)胞，克隆全套抗體可變區(qū)基因，利用序列重疊延伸法，按VH-1inker-VL的拼接方式，通

3、過20次電轉(zhuǎn)化構(gòu)建了庫容為1．6×108的單鏈抗體免疫文庫。以表位肽為篩選靶標(biāo)，通過3—4輪的富集篩選及競爭抑制實驗得到與表位肽特異結(jié)合的噬菌體單鏈抗體。其中針對6，7，8號表位肽的噬菌體單鏈抗體ScFv-P6-12，ScFv-P7-8，ScFv—P8-12可延長100LDs~BoNT／B攻擊小鼠的死亡時間，具有中和保護(hù)作用。 將篩選到的一株針對P8表位肽的單鏈抗體ScFv—P8-12與MBP融合表達(dá)，通過與人源抗體的同源比對，

4、結(jié)合計算機(jī)輔助設(shè)計及PCR點(diǎn)突變技術(shù)，替換框架區(qū)中與人源抗體差異較大同時不影響CDR功能的殘基，對融合抗體進(jìn)行初步的人源化改造。改造后的抗體保持親本抗體的結(jié)合活性及對動物的中和保護(hù)作用，利用SPR技術(shù)經(jīng)BIAcore儀器分析表明改造后抗體的親和力為1．34×10-9M。以上研究表明，通過表位預(yù)測，利用噬菌體展示抗體文庫技術(shù)獲得了針對BoNT/B表位的具有中和保護(hù)作用的抗體；融合表達(dá)后經(jīng)初步的人源化改造仍具有親本抗體的活性，為今后進(jìn)一步進(jìn)