肉毒毒素A型、B型卵黃抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、肉毒毒素(botulinum toxin，BoNT)是一種烈性外毒素蛋白，由厭氧肉毒梭菌（Clostridium botulinum）在生長繁殖過程中所產(chǎn)生，是目前自然界已知毒性最強(qiáng)的生物物質(zhì)。由于毒性極強(qiáng)、制備容易等特點，BoNT被認(rèn)為是最重要的致死性生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑，其對社會安全與民眾健康的潛在威脅不容忽視。目前，臨床有效治療肉毒中毒的方法是及時給患者注射多價馬血清抗毒素，然而在實際應(yīng)用中受到了很大的限制。因此，發(fā)展新的治療性抗

2、體，具有十分重要的社會和軍事意義。
　　本研究的主要目的是獲取BoNT重鏈碳端重組蛋白（AHc和BHc）在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)產(chǎn)物，通過分別免疫來航雞制備特異性抗體anti-AHc IgY和anti-BHc IgY，并完成鼠模型的被動治療評價，為IgY抗體應(yīng)用于肉毒中毒的臨床預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。
　　首先，通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建載體表達(dá)獲得目的蛋白AHc和BHc。對兩組基因序列大腸桿菌密碼子優(yōu)化，分別構(gòu)建含有該目的片

3、段的重組表達(dá)質(zhì)粒pTIG-Trx-AHc、pTIG-Trx-BHc，經(jīng)過PCR和酶切鑒定正確后分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中。經(jīng)過測序鑒定，所合成的重組基因AHc和BHc均與預(yù)期結(jié)果一致，其開放閱讀框架全長分別為1332bp、1314 bp。構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pTIG-Trx-AHc、pTIG-Trx-BHc PCR雙酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期相符。經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化，將構(gòu)建好的表達(dá)菌株BL21(DE3)/pTIG-Trx-AH

4、c、BL21(DE3)/pTIG-Trx-BHc分別在0.3和0.2 mol/L IPTG、16℃條件下表達(dá)。在此條件下，兩種重組蛋白均可以獲得可溶性表達(dá)占菌體裂解液上清的20％，超聲碎菌后的上清溶液分別經(jīng)過Ni-NTA親和純化后，獲得純度可以達(dá)到95％以上的目的蛋白AHc和BHc。在Western Blot鑒定實驗中，AHc和BHc蛋白可分別與抗天然BoNT/A、BoNT/B馬血清抗毒素發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)。
　　然后，通過四

5、次連續(xù)免疫健康母雞獲得高效價的特異性IgY抗體。純化后的AHc蛋白與等體積的完全弗氏佐劑混合，乳化充分后，按照200μg/只的劑量經(jīng)分別肌肉多點注射。在首次免疫后每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，共四次，加強(qiáng)免疫使用等體積的非完全弗氏佐劑與兩種目的蛋白混合乳化，免疫劑量和方法與首次相同。首次免疫前一天以及每次免疫后一周采集雞蛋和血清樣本，編號后放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?。免疫過程中收集到的樣品均采用間接ELISA方法進(jìn)行檢測抗體效價;第四次免疫后一周收集

6、到的雞蛋樣品通過水稀釋和硫酸銨鹽析法從雞蛋中提取純化特異性anti-AHc IgY抗體。采用相同的方法制備和純化anti-BHc IgY抗體。分別四次免疫健康母雞后，在AHc和BHc實驗組收集到的血清和雞蛋樣品中均檢測到特異性的抗體。免疫后血清中檢測到的抗體效價可達(dá)到1∶106，而卵黃抗體效價約1∶105，并且抗體效價可以穩(wěn)定保持一個月不下降。
　　最后，測定了純化獲得的anti-AHc IgY和anti-BHc IgY抗體的效價

7、，并在小鼠模型中對中和效果進(jìn)行了評價。在厭氧條件下培養(yǎng)A型、B型肉毒梭菌，收集的產(chǎn)毒培養(yǎng)基純化處理，最終分離得到具有生物活性的BoNT/A和BoNT/B毒素。在BALB/c小鼠模型中測定兩種天然毒素的半數(shù)致死劑量，其中BoNT/A攻毒方式為腹腔注射、BoNT/B為腹腔注射和灌胃注射。
　　為了測定評價anti-AHc IgY抗體的中和活性，3個濃度的IgY(100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml)溶液分別與3個濃度的

8、BoNT/A(100× LD50、200× LD50、400× LD50)在明膠-磷酸鹽緩沖液體系中等體積預(yù)先混合，在37℃恒溫水浴箱中孵育30-45 min，取0.2 ml樣品混合物小鼠腹腔注射檢測。對注射后的小鼠進(jìn)行96 h觀察，每隔6h觀察一次，記錄小鼠生存狀態(tài)和死亡情況，生存曲線用Prism5統(tǒng)計學(xué)軟件繪制。之后，利用相同的動物方法測定anti-BHc IgY抗體的中和活性。4× LD50/i.p.BoNT/B溶液分別與等體積倍

9、比稀釋的系列anti-BHc IgY抗體混合腹腔注射檢測，4× LD50/i.g.BoNT/B溶液分別與等體積倍比稀釋的系列anti-BHc IgY抗體混合灌胃注射檢測。在天然BoNT/A攻毒試驗，anti-AHc IgY可以在體外預(yù)混合后可以有效的中和毒素的活性。其中，40 ng的anti-AHcIgY可以抵抗最高劑量為20× LD50天然BoNT/A毒素的攻擊，保護(hù)率均為100％。在anti-BHc IgY攻毒保護(hù)實驗中，不同劑量的

10、anti-BHc IgY對天然毒素BoNT/B的中和能力有所不同。實驗組小鼠在注射毒素-抗體混合物后，中毒癥狀相比對照組明顯減輕并且生存率也隨著anti-BHc IgY抗體含量劑量的增加而增加。
　　在抗體-毒素體外預(yù)混的實驗基礎(chǔ)上，anti-BHc IgY給藥途徑和BoNT/B攻毒途徑不同分別通過不同的途徑注射模擬研究IgY抗體在毒素預(yù)防和治療中的作用。首先，通過小鼠實驗測定腹腔攻毒時抗體灌胃給藥時時間與小鼠生存情況之間的關(guān)系。

11、4× LD50/i.g.劑量灌胃攻毒時，過量IgY抗體（10 mg/kg）在不同的時間點通過腹腔途徑給藥。然后，在測定IgY注射時間同小鼠生存情況關(guān)系的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測定不同劑量的IgY抗體對BoNT/B毒素中和能力的影響。之后，采用相同的方法分析灌胃攻毒，測定IgY抗體腹腔給藥時間和劑量與最終小鼠生存情況之間的關(guān)系。通過分析測定灌胃攻毒時抗體腹腔給藥時時間、劑量與小鼠生存情況之間的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)anti-BHc IgY腹腔注射時間和劑

12、量影響抗體對4× LD50/i.g.BoNT/B的中和能力。在攻毒后1.5h注射anti-BHc抗體后，實驗組小鼠中毒癥狀相比對照組明顯減輕。在劑量實驗中，注射GPB緩沖液的對照組和低劑量anti-BHc IgY實驗組小鼠表現(xiàn)出了經(jīng)典的肉毒中毒癥狀，均在36h以內(nèi)死亡。10和20μg/kg IgY劑量組小鼠的存活時間延長，但不能完全保護(hù)小鼠免受4× LD50/i.p.劑量的毒素攻擊;隨著anti-BHc IgY劑量升高到40和80μg/

13、kg，在4× LD50/i.p的毒素攻擊下兩組小鼠均全部存活。此外，通過灌胃途徑檢測anti-BHc IgY對天然毒素BoNT/B的中和能力實驗也獲得了類似的結(jié)果。隨著IgY的劑量的增加（從0.2mg/kg到0.4mg/kg），小鼠的存活率也隨之升高;當(dāng)IgY為0.8和1.6 mg/kg時可以完全中和BoNT/B的毒素活性。
　　本研究實現(xiàn)了AHc、BHc兩種重組蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)，且保留了良好的抗原性;重組蛋白能夠

14、有效刺激健康母雞發(fā)生免疫反應(yīng)，穩(wěn)定、大量制備高效價IgY，血清中檢測到的抗體效價可達(dá)到1∶106，而卵黃抗體效價約1∶105;在小鼠模型實驗中呈現(xiàn)除較好的中和活性，40 ng的anti-AHc IgY可以抵抗最高劑量為20×LD50天然BoNT/A的攻擊，40μg anti-BHc IgY在4× LD50/i.p的BoNT/B毒素攻擊下兩組小鼠均全部存活。此外，anti-BHc IgY不僅可以在體外混合中有效中和毒素的活性，還可以在小鼠