高植酸酶高蛋白二價(jià)營養(yǎng)飼料酵母工程菌構(gòu)建及其發(fā)酵的初步研究.pdf

1、谷物和油料作物是食品和飼料的主要來源，其中無機(jī)磷的含量是衡量其營養(yǎng)價(jià)值高低的標(biāo)準(zhǔn)之一。在生物質(zhì)原料中，相當(dāng)數(shù)量的一部分磷元素是以肌醇六磷酸磷酸鹽(又稱植酸鹽)的形式存在的。植酸鹽在營養(yǎng)學(xué)中被認(rèn)為是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，其表現(xiàn)為對無機(jī)鹽強(qiáng)烈的強(qiáng)螯合作用以及對蛋白的強(qiáng)絡(luò)合能力，最終導(dǎo)致多種營養(yǎng)元素不能被動(dòng)物吸收利用，在很大程度上降低了食品和飼料的營養(yǎng)價(jià)值。植酸酶是可以催化植酸鹽脫掉磷酸基團(tuán)反應(yīng)的一種蛋白酶。在飼料中人為的補(bǔ)加外源植酸酶制劑，是解除

2、飼料中由植酸鹽引起的抗?fàn)I養(yǎng)等消極作用，提高飼料營養(yǎng)價(jià)值的有效途徑，其缺點(diǎn)在于在提高飼料營養(yǎng)價(jià)值的同時(shí)也提高了飼料的成本。 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一種公認(rèn)安全的微生物(GRAS)，具有較高的蛋白含量及其它營養(yǎng)成分而被廣泛應(yīng)用于食品與飼料中。利用基因工程手段，改造具有較高蛋白含量的面包酵母，使其同時(shí)具有高植酸酶活性，成為二價(jià)營養(yǎng)飼料酵母，用于飼料或飼料添加劑，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中有著重要的意義。

3、 本文通過PCR擴(kuò)增獲得黑曲霉的植酸酶基因phyA，將其連接于釀酒酵母多拷貝整合載體上，構(gòu)建含有植酸酶基因的高拷貝釀酒酵母工業(yè)菌株重組表達(dá)質(zhì)粒(pYMIKP-phyA)。利用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的釀酒酵母工業(yè)菌株轉(zhuǎn)化方法，將重組質(zhì)粒線性化后，轉(zhuǎn)化具有高蛋白含量的面包酵母工業(yè)菌株，獲得面包酵母重組工業(yè)菌株。提取轉(zhuǎn)化子的染色體，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)，證明了phyA基因在工業(yè)酵母基因組中的整合。染色體中整合入不同拷貝數(shù)G418抗性基因的轉(zhuǎn)化

4、子對培養(yǎng)基中的G418抗性不同，表現(xiàn)為在含有相同濃度G418的YEPD固體平板培養(yǎng)基上的生長情況有所不同。因此，利用G418抗性平板點(diǎn)滴試驗(yàn)，篩選具有較高拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過兩輪篩選后，獲得一株高表達(dá)植酸酶phyA基因的重組酵母菌株YP-6。YEPD培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵的酶活測定結(jié)果表明，重組酵母菌株YP-6表現(xiàn)出的表觀植酸酶比酶活可達(dá)55.61U／mg蛋白，較出發(fā)菌株提高了1.65倍。 將獲得的高蛋白高植酸酶活性的二價(jià)飼料營養(yǎng)酵母重

5、組菌株YP-6在飼料淀粉水解液培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，對其發(fā)酵性能進(jìn)行初步研究。分析發(fā)酵固形產(chǎn)物中植酸酶的含量，并對發(fā)酵產(chǎn)物的后期處理方式做初步探索。結(jié)果表明，重組菌株YP-6在淀粉水解液培養(yǎng)基中經(jīng)過一段時(shí)間的生長，在菌體量達(dá)到頂峰過后很短的時(shí)間內(nèi)胞內(nèi)積累的植酸酶含量也達(dá)到頂峰。固形物中植酸酶含量最高可達(dá)2380U/g干物質(zhì)，與市售的單位為2500U/g的商品化植酸酶制劑活性相當(dāng)，可用于飼料或輔料的生產(chǎn)。由于產(chǎn)生的植酸酶存在于胞內(nèi)，在儲(chǔ)藏