舒尼替尼在荷腎癌裸鼠體內(nèi)的時(shí)辰藥理學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)皮下接種構(gòu)造ACHN人腎細(xì)胞腺癌移植瘤Balb/c裸鼠模型，探究舒尼替尼（Sunitinib,SU）時(shí)辰給藥的藥效學(xué)及藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)，并從時(shí)辰基因、代謝酶等多個(gè)方面探究其可能的藥效作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.建立裸鼠腎癌模型：將4周齡的Balb/c裸鼠置于嚴(yán)格的明暗環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)兩周，將培養(yǎng)好的ACHN人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞于裸鼠右上肢皮下注射，建立Balb/c裸鼠移植瘤模型。
　　2.藥效學(xué)研究的隨

2、機(jī)分組：將裸鼠模型隨機(jī)分為4：00、8:00、12:00、16:00、20:00、24:00六個(gè)時(shí)辰組，每個(gè)時(shí)辰組又隨機(jī)分為舒尼替尼給藥組和模型組。
　　3.藥效學(xué)研究的時(shí)辰給藥及檢測(cè)指標(biāo)：舒尼替尼給藥組分別在對(duì)應(yīng)的六個(gè)時(shí)辰點(diǎn)灌胃給予16.25mg·kg-1舒尼替尼溶液0.2mL，模型組則在同樣的時(shí)辰點(diǎn)給以等量的CB（Citrate buffer,檸檬酸鹽緩沖液,PH=4.5）。在給藥期間每三天對(duì)腫瘤的長(zhǎng)短徑進(jìn)行一次測(cè)量以計(jì)算其體

3、積，根據(jù)其體積變化趨勢(shì)繪制出腫瘤體積生長(zhǎng)曲線。至第21天則分別于相應(yīng)時(shí)辰點(diǎn)處死裸鼠，剝離瘤體稱重并制作病理切片以比較各組腫瘤的病理形態(tài)。
　　4.藥動(dòng)學(xué)研究的隨機(jī)分組：將裸鼠模型隨機(jī)分為4:00、8:00、12:00、16:00、20:00、24:00六個(gè)時(shí)辰組，每個(gè)時(shí)辰組又分為舒尼替尼給藥組和模型組。每個(gè)給藥組包括15 min、30 min、1h、3h、5 h、7 h、9 h、14 h、19 h、24 h共10個(gè)取血點(diǎn)。每個(gè)時(shí)辰

4、組設(shè)置正常裸鼠作為空白對(duì)照組。
　　5.藥動(dòng)學(xué)研究的時(shí)辰給藥及檢測(cè)指標(biāo)：給藥組于六個(gè)時(shí)辰點(diǎn)分別灌胃給以舒尼替尼16.25mg·kg-1，并于給藥后15 min、30 min、1h、3h、5 h、7 h、9 h、14 h、19 h、24 h摘眼球取血0.5mL，離心取血漿置-80℃保存，采用HPLC-MS/MS（high-performance liquid chromatography coupled with tandem ma

5、ss spectrometry,高效液相色譜法聯(lián)合質(zhì)譜）的方法測(cè)定不同時(shí)辰點(diǎn)舒尼替尼及其主要活性代謝物 N-去乙基舒尼替尼（SU12662）的血藥濃度，并用WinNonlin6.3計(jì)算各時(shí)辰點(diǎn)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。取血后迅速處死裸鼠，并立即取肝臟于-80℃冷凍保存。
　　6.相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測(cè)：從肝組織中提取總 RNA采用qRT-PCR（Quantificational Real Time-PCR,實(shí)時(shí)熒光定量PCR）檢測(cè)cyp3a1

6、1（cytochrome P450 enzyme3a11,細(xì)胞色素P450酶3a11）、cyp3a13、Bmal-1（brain and muscle arnt-like protein-1,時(shí)辰基因編碼芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)樣蛋白）、Clock（circadian locomotor output cycles kaput,生物鐘循環(huán)輸出蛋白）及時(shí)辰基因的作用位點(diǎn)Dbp（D site-binding protein，D-位點(diǎn)結(jié)合蛋白）的表達(dá)

7、。
　　結(jié)果：
　　1.舒尼替尼在荷瘤裸鼠體內(nèi)的時(shí)辰藥效學(xué)具有晝夜節(jié)律性，與模型組相比，各時(shí)辰給藥組的腫瘤體積增長(zhǎng)速度均有所減慢，腫瘤重量也有不同的減輕。16:00組的腫瘤生長(zhǎng)曲線坡勢(shì)陡直，與其他五個(gè)給藥組相較，腫瘤體積增長(zhǎng)迅速，抑瘤率最低；8:00、12:00給藥組與16:00及20:00給藥組相比，腫瘤體積生長(zhǎng)緩慢，抑瘤率高，有顯著性差異（p<0.05），其中8:00給藥組腫瘤受抑制情況最為明顯。病理切片結(jié)果顯示，16:

8、00及20:00給藥組腫瘤組織細(xì)胞排列基本無(wú)間隙，邊界較為清楚，腫瘤壞死量少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況輕微；8:00及12:00給藥組中大量的腫瘤細(xì)胞是壞死的，表現(xiàn)出嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和血管破裂出血。
　　2.舒尼替尼在荷瘤裸鼠體內(nèi)的時(shí)辰藥動(dòng)學(xué)具有晝夜節(jié)律性，相比其他各時(shí)辰給藥組，16:00與20:00給藥組AUC0-24h較低，清除率高；8:00及12:00給藥組裸鼠體內(nèi)總藥物具有更高的AUC0-24h、MRT0-24h和更低的CL/F

9、，在體內(nèi)駐留時(shí)間長(zhǎng)，血藥濃度高，與16:00給藥組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。與藥效學(xué)研究結(jié)果相一致。
　　3.代謝酶基因 cyp3a11、cyp3a13及時(shí)辰基因 Bmal-1、Clock、Dbp在荷腎癌裸鼠肝臟組織中的表達(dá)顯示出顯著的晝夜節(jié)律性。模型組代謝酶基因cyp3a11、時(shí)辰基因Bmal-1在12:00至20:00時(shí)間范圍內(nèi)表達(dá)量高，在16:00表達(dá)最高，達(dá)到峰值； cyp3a13及 Clock表達(dá)量自8:00起

10、呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，在20:00至24:00時(shí)間段內(nèi)坡度最大，增長(zhǎng)速率最為迅速。結(jié)合位點(diǎn)蛋白Dbp在16:00、24:00均有較高程度的表達(dá)。在不同的時(shí)間點(diǎn)給予舒尼替尼后，16:00組Bmal-1、cyp3a11總體表達(dá)量最高；24:00組Clock、Dbp及cyp3a13總體表達(dá)量最高，其中Clock及cyp3a13在20:00組也有較高的表達(dá)。時(shí)辰基因與代謝酶基因的整體表達(dá)趨勢(shì)具有一致性。
　　結(jié)論：
　　舒尼替尼在荷瘤