NO供體藥物JS-K在新建HBV感染細(xì)胞模型中的抗病毒效應(yīng)初探.pdf

1、目的：建立NTCP過(guò)表達(dá)的HBV感染細(xì)胞模型，利用該模型探討NO供體藥物JS-K的抗病毒效應(yīng)。
　　方法：⑴?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（NTCP)慢病毒載體構(gòu)建及NTCP-SK-Hep1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立：構(gòu)建NTCP慢病毒重組質(zhì)粒Gv-NTCP，挑取克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定；將陽(yáng)性重組質(zhì)粒Gv-NTCP與慢病毒輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚腎HEK293T細(xì)胞，包裝Gv-NTCP慢病毒、測(cè)定其滴度；Gv-NTCP慢病毒感染人肝癌細(xì)胞株SK-He

2、p1，嘌呤霉素篩選，通過(guò)熒光顯微鏡，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)NTCP的表達(dá)；⑵構(gòu)建HBV陽(yáng)性血清感染NTCP-SK-Hep1細(xì)胞模型：二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide， DMSO）、地塞米松預(yù)處理NTCP-SK-Hep1細(xì)胞系2d，HBV陽(yáng)性血清、4％聚乙二醇8000（PEG）共孵育NTCP-SK-Hep1細(xì)胞系16 h，建立HBV感染細(xì)胞模型，設(shè)NC-SK-Hep1細(xì)胞系為對(duì)照

3、組進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）及熒光探針定量PCR技術(shù)驗(yàn)證細(xì)胞模型是否構(gòu)建成功；⑶JS-K抗HBV的效應(yīng)初探：不同濃度的JS-K作用于HBV感染細(xì)胞模型，設(shè)病毒對(duì)照組及恩替卡韋（Entecavir，ETV）陽(yáng)性藥物對(duì)照組，采用四甲基偶氮唑鹽（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl Tetrazolium b

4、romide，MTT）比色法、ELISA、熒光探針定量PCR技術(shù)檢測(cè)JS-K對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用及對(duì)細(xì)胞上清中的乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B surface Agent，HBsAg）、乙肝病毒e抗原（Hepatitis B e Agent， HBeAg）及HBV DNA含量的影響。
　　結(jié)果：①NTCP慢病毒載體構(gòu)建及NTCP-SK-Hep1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立：測(cè)序結(jié)果證實(shí)Gv-NTCP慢病毒載體構(gòu)建成功；在HEK293

5、T細(xì)胞中包裝的Gv-NTCP重組慢病毒滴度為2.0×108 TU/mL；Gv-NTCP重組慢病毒感染SK-Hep1細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)感染細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，PCR及凝膠結(jié)果顯示感染組的NTCP表達(dá)明顯增高（P<0.05），Western blot結(jié)果顯示感染組的NTCP蛋白表達(dá)明顯增高（P<0.05），表明NTCP-SK-Hep1細(xì)胞構(gòu)建成功；②HBV陽(yáng)性血清感染NTCP-SK-Hep1細(xì)胞模型的構(gòu)建：NTCP-SK-Hep1細(xì)胞

6、系及NC-SK-Hep1細(xì)胞株經(jīng)過(guò)預(yù)處理后進(jìn)行HBV感染，感染后第2天到第6天，細(xì)胞能夠持續(xù)分泌HBsAg及HBeAg，細(xì)胞上清中也能夠持續(xù)檢測(cè)到HBV DNA，且NTCP-SK-Hep1組的表達(dá)水平均明顯高于NC-SK-Hep1組（P<0.05），檢出時(shí)間也長(zhǎng)于后者。③JS-K抗HBV的效應(yīng)初探：MTT結(jié)果顯示JS-K在小于10μM的濃度范圍內(nèi)對(duì)HBV感染的NTCP-SK-Hep1細(xì)胞無(wú)增殖抑制作用， JS-K的IC50為60.6μM