DLL4在胃癌中的表達及與中醫(yī)證相關性研究.pdf

1、目的：
　　Delta-like ligand4(DLL4)是腫瘤血管發(fā)生的關鍵調節(jié)因子。血管內皮生長因子(VEGF)是在血管內皮細胞中表達的生長因子，能促進腫瘤血管形成，提供腫瘤生成所需要的氧和營養(yǎng)成份，并增加血管和淋巴管通透性而促進腫瘤生長和轉移。本研究通過檢測胃癌(Gastric cancer, GC)組織中DLL4蛋白的表達情況探討DLL4的表達與臨床病理特征之間的關系，比較胃癌不同中醫(yī)(Traditional Chine

2、se Medicine，TCM)證型患者的DLL4蛋白表達水平。以及驗證DLL4與VEGF在胃癌細胞中的表達情況，檢測干擾DLL4的表達對VEGF表達的影響，并初步探討DLL4對胃癌細胞增殖和遷移能力的作用及機制。
　　方法：
　　1、收集44例胃腸外科手術切除的胃癌組織及距病灶約5cm的癌旁正常胃粘膜組織制作組織切片，采用免疫組化檢測胃癌組織及癌旁組織DLL4蛋白的表達，并分析DLL4蛋白表達與胃癌臨床病理特征的之間的關系

3、。對切除胃癌組織的患者進行中醫(yī)辨證分型，分析胃癌證型與分期的相關性以及比較胃癌不同中醫(yī)證型患者的DLL4蛋白表達水平。
　　2、提取胃癌AGS、SGC-7901細胞株和正常胃黏膜GES-1細胞株的總RNA，用RT-PCR驗證細胞中DLL4、VEGFmRNA的表達。
　　3、構建4種靶向DLL4基因的干擾RNAi質粒及1種對照質粒，用FuGENE(@) HD介導轉染胃癌AGS細胞，嘌呤霉素（濃度為0.2μg/mL）篩選建立穩(wěn)定

4、細胞株。
　　4、提取DLL4-RNAi的干擾組和CON077對照組胃癌細胞株總RNA，RT-PCR檢測DLL4、VEGF的mRNA表達情況。
　　5、選取轉染后對DLL4、VEGF表達有明顯干擾作用的胃癌AGS細胞株DLL4-RNAi(34251)和DLL4-RNAi(34253)組為實驗組，以未轉染的胃癌AGS細胞設為對照組，MTT檢測DLL4被干擾后胃癌AGS細胞的增殖情況。
　　6、選取對DLL4表達有明顯干擾

5、作用的胃癌AGS細胞株DLL4-RNAi(34253)組為實驗組，未轉染過的胃癌AGS細胞為對照組，劃痕實驗觀察干擾DLL4表達后胃癌AGS細胞的遷移情況。
　　結果：
　　1、在44例胃癌組織標本中，DLL4蛋白染色呈棕黃色陽性顆粒，主要分布于腫瘤細胞膜和細胞質。胃癌組織DLL4蛋白陽性表達率平均為70.5％，正常胃癌粘膜組織未見棕黃色顆粒。DLL4蛋白在胃癌中的表達與腫瘤的浸潤深度顯著相關(p＜0.01)、淋巴結轉移有關

6、(p＜0.05)和臨床分期顯著有關(p＜0.01)，而與患者的性別、年齡、腫瘤位置等因素無關(p＞0.05)。
　　2、6種中醫(yī)證型在胃癌分期中的分布不同，x2=11.071，p＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。不同中醫(yī)證型胃癌組織中DLL4的陽性表達不同，x2=12.774，p＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。胃癌6種中醫(yī)證型DLL4陽性表達率由高到低依次為氣滯血瘀證、脾胃虛寒證、胃熱傷陰證、氣血虧虛證、痰濕凝結證、肝氣犯胃證。

7、r>　　3、RT-PCR結果顯示DLL4、VEGF mRNA在胃癌AGS、SGC-7901細胞株的表達均高于正常胃黏膜GES-1細胞。
　　4、RT-PCR結果顯示，構建的4個DLL4-RNAi序列其中有3個質粒能抑制DLL4的表達，其中DLL4-RNAi(34253)、DLL4-RNAi(34251)抑制DLL4 mRNA表達與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05); DLL4-RNAi(34251)抑制VEGF mRNA

8、表達與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，DLL4-RNAi(34253)能有效抑制VEGF mRNA表達。且VEGF mRNA表達量與DLL4表達量之間存在正相關關系。
　　5、MTT實驗結果顯示，轉染DLL4-RNAi(34253)和DLL4-RNAi(34251)的AGS細胞與對照組的細胞相比增殖速率減慢，其中轉染DLL4-RNAi(34253)的胃癌細胞增殖與對照組比差異極顯著(p＜0.01）。
　　6、劃

9、痕實驗結果顯示，轉染DLL4-RNAi(34253)的AGS細胞的遷移率比對照組明顯降低(p＜0.01）。
　　結論：
　　胃癌組織中高表達DLL4蛋白，DLL4蛋白的表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移和臨床分期相關，與患者的性別、年齡、腫瘤位置無關。中醫(yī)證型與胃癌TNM分期之間存在相關性，脾胃虛寒證、肝氣犯胃證多見于早期胃癌。胃癌不同中醫(yī)證型之間，DLL4陽性表達存在差異。成功構建了干擾DLL4表達的質粒，建立了穩(wěn)定抑制DL