Acinetobacter baumannii利用LPS抵御抗生素TA的入侵.pdf

1、雖然鮑氏不動桿菌（Acinetobacter baumannii）曾經(jīng)被認(rèn)為是一個低毒力的細(xì)菌，但是該菌目前已被世界各大醫(yī)療機(jī)構(gòu)公認(rèn)為最具危險性的條件致病菌之一。盡管不動桿菌屬在自然界中無處不在，并且非常容易從自然環(huán)境中分離得到，但是A.baumannii除了在醫(yī)院環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)以外，很難從自然界中分離得到。根據(jù)目前已知報道，A.baumannii已經(jīng)涉及到多種與高發(fā)病率或高死亡率相關(guān)的醫(yī)院內(nèi)感染，例如呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、傷口感染、血液感染

2、、繼發(fā)性腦膜炎、皮膚及軟組織感染和泌尿道的感染等。然而A.baumannii能夠在多種生物和非生物表面上形成生物膜以及能夠抵抗多種抗生素入侵的能力在A.baumannii引發(fā)醫(yī)院內(nèi)大面積感染的過程中起到了十分重要的作用。
　　許多A.baumannii株能夠?qū)⑵涓∮蔚募?xì)胞附著到不同的親水或疏水固體基質(zhì)的表面，例如醫(yī)院設(shè)備，生物體內(nèi)留置的醫(yī)療裝置以及支氣管上皮細(xì)胞等等。由其自身分泌產(chǎn)生的胞外基質(zhì)(ECM)包裹在A.baumannii

3、細(xì)胞的表面，最終在被附著固體基制的表面形成生物膜。這種生物膜式的生活方式能夠?yàn)锳.baumannii細(xì)胞提供一種穩(wěn)定的保護(hù)措施，允許其在惡劣的環(huán)境中生存并伺機(jī)繁殖到新的環(huán)境中去，這在一定程度上提高了院內(nèi)感染的風(fēng)險。
　　基于此，我們對A.baumannii的成膜性進(jìn)行了分析。我們分別選取了不同親/疏水特性的塑料和玻璃材質(zhì)作為固體基質(zhì)，觀察A.baumannii野生菌株和耐colistin突變菌株在其上面形成生物膜的能力。結(jié)果顯示，

4、相較于親水性的固體基質(zhì)，無論是A.baumannii野生菌株還是耐colistin突變菌株都傾向于在疏水性的固體基質(zhì)上形成生物膜。隨后，我們又試圖從物理和化學(xué)的角度去尋找可以去除A.baumannii生物膜的方法。通過對比，我們發(fā)現(xiàn)相比于超聲清洗而言，采用SDS處理之后殘存的A.baumannii生物膜明顯下降。
　　除了可以在固體基質(zhì)表面形成生物膜以外，目前臨床上報道的A.baumannii菌株均表現(xiàn)出多重耐藥的能力(multi

5、drug-resistant MDR)。這是由于A.baumannii菌株自身具備多種抗生素的抗性機(jī)制所致:例如滲透性的缺陷，表達(dá)多種抗生素外排泵，產(chǎn)生可以降解或修飾抗生素的酶類以及改變抗生素藥物作用的靶點(diǎn)。除此之外，A.baumannii菌株具有很強(qiáng)的從外界獲取新遺傳因子的能力。這種能力使得A.baumannii菌株的基因組變得更加開放，同時也在A.baumannii具備多重耐藥表型的形成過程中發(fā)揮了重要作用。
　　隨著臨床上抗

6、生素的大量使用，A.baumannii菌株的多重耐藥能力逐漸增強(qiáng)，然而新型抗生素的研發(fā)卻處于嚴(yán)重滯后的狀態(tài)。尋找具有較廣抗菌譜的新型抗生素成為一項(xiàng)迫在眉睫的任務(wù)。粘細(xì)菌可以產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物，并且多數(shù)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)比較新穎并且具有很好的抑菌活性。與鮑氏不動桿菌不同，黃色粘球菌屬于非條件致病菌，它主要存在于自然界的土壤中。在分類上屬于變形菌門的δ-proteobacterium分支。作為一類捕食者，黃色粘球菌可以裂解被捕食細(xì)胞并利用其釋

7、放出來的營養(yǎng)物質(zhì)供其自身生長，作為黃色粘球菌重要的武器——抗生素TA在這個過程中起到了重要作用。
　　在前期的篩選過程中我們發(fā)現(xiàn)黃色粘球菌DK1622細(xì)胞可以捕食A.baumannii耐colistin的突變菌株但是卻無法捕食Abaumannii野生菌株。隨后，我們對黃色粘球菌DK1622進(jìn)行了大規(guī)模發(fā)酵，從其發(fā)酵液中純化出了抗生素TA。抑菌實(shí)驗(yàn)表明，A.baumannii耐colistin的突變菌對抗生素TA變得十分敏感，但是A

8、.baumannii野生菌株卻可以抵抗抗生素TA的入侵。已有文獻(xiàn)報道了抗生素TA的作用靶點(diǎn)是lspA基因編碼的二型信號肽酶。我們對A.baumannii突變株和野生株中的lspA基因進(jìn)行了測序分析，沒有從中找到突變位點(diǎn)。同時qPCR的結(jié)果顯示，A.baumannii突變株對抗生素TA變得十分敏感也不是由lspA表達(dá)水平變化所引起的。隨后我們提取了A.baumannii野生株和突變株的脂多糖(LPS)，通過SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，A

9、.baumannii突變株的LPS相較于野生株來說其結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。通過測序分析，我們也進(jìn)一步在lipid A的合成基因中發(fā)現(xiàn)了突變位點(diǎn)。同時，細(xì)胞通透性實(shí)驗(yàn)表明，A.baumannii突變株的LPS結(jié)構(gòu)發(fā)生變化后，其細(xì)胞膜的透性大幅度提高。親脂性的非特異性熒光探針能夠順利進(jìn)入到胞內(nèi)。鑒于抗生素TA屬于一類親脂性抗生素，A.baumannii胞外LPS的存在作為一道天然的屏障阻礙了抗生素TA的入侵，從而促使A.baumannii野生株對

10、抗生素TA不敏感。
　　中國的濃香型白酒屬于大曲制酒，在天然窖泥池中經(jīng)過幾個月的封閉固態(tài)發(fā)酵完成釀制。窖泥中存在、生長、富集和演替的微生物參與了整個釀酒過程。窖泥微生物的區(qū)系組成和代謝行為不但決定濃香型白酒的品質(zhì)，同時也是形成濃香型白酒主體香型的主要決定因素。
　　為了分析濃香型白酒釀酒窖池中微生物的群落結(jié)構(gòu)，我們與四川某酒廠合作，分別從1年新窖池和10年老窖池的上（距離頂端約0-20 cm）、中（距離頂端約80-100 c

11、m）、下層中刮取了窖泥，從中提取了總基因組DNA。通過設(shè)計(jì)專門的引物對窖泥中古細(xì)菌和細(xì)菌的16S rRNA基因中的V3-V5區(qū)域（約500 bp）進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并采用pyrosequencing的方法進(jìn)行高通量測序分析。我們從6組窖泥樣品中得到了60，894條序列，采用mothur軟件（version1.27.0，http://www.mothur.org/）剔除掉低質(zhì)序列以及嵌合體序列后最終得到54，634條優(yōu)質(zhì)序列，平均讀長51

12、4±60 bp。
　　結(jié)果顯示，1年新窖池和10年老窖池的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較為明顯，老窖池中的細(xì)菌種類明顯比新窖池中的細(xì)菌種類豐富，尤其是古細(xì)菌存老窖池中更為豐富和多樣。同種窖池的上、中、下層中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也存在明顯的差異性。隨著時間的推移，老窖池的上、中、下層中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)雖然也存在差異，但是這種差異性相較于新窖池而言明顯變小。
　　窖池中的微生物參與了整個發(fā)酵過程，同時他們的代謝行為也影響了濃香型白酒的品質(zhì)。為了評估

13、不同的窖泥細(xì)菌的代謝能力，我們試圖從老窖池的下層窖泥中分離純化功能細(xì)菌。最終共得到了32株細(xì)菌，分屬于Bacillus、Rummeliibacillus、Clostridium和Paenibacillus四個屬。根據(jù)進(jìn)化分析的結(jié)果，我們從上述4個屬種挑選了10株代表菌株進(jìn)行了發(fā)酵，結(jié)合GC/MS分析我們發(fā)現(xiàn)所有這些菌株都能夠產(chǎn)生多種有機(jī)化合物，包括醇，醚，醛，酮，酸，芳香族化合物，少量的雜環(huán)化合物以及它們的衍生物。同時我們利用GC/MS

14、分析了1年新窖池和10年老窖池釀造的原漿白酒，發(fā)現(xiàn)其中的揮發(fā)性物質(zhì)主要是各種酯、醇、脂肪酸、醛、縮醛、酮、內(nèi)酯、呋喃衍生物和雜環(huán)化合物，其中酯、醇和脂肪酸是主要成分。這些主要成分恰恰是由窖泥細(xì)菌代謝產(chǎn)生的小分子化合物參與構(gòu)成的。通過對比我們還發(fā)現(xiàn):低分子量的酯類化合物（例如乳酸乙酯和己酸乙酯）在10年老窖池釀造的白酒中含量要明顯高于1年新窖池釀造的白酒。然而一些高分子量的酯類化合物（例如棕櫚酸乙酯，亞油酸乙酯，和油酸乙酯）在1年新窖池釀