緩激肽對(duì)高糖誘導(dǎo)人系膜細(xì)胞表達(dá)CTGF和FN的影響及與JNK途徑的相關(guān)性.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)永生代人系膜細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察緩激肽(bradykinin，BK)對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)締組織生長因子(connectivetissue growth factor，CTGF)、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)及C-Jun氨基末端激酶(C-JunNH<,2>-terminal kinase，JNK)通路活化的影響，采用BK-B<,2>受體阻斷劑、JNK通路阻斷劑探討B(tài)K對(duì)CTGF和FN的影響與JNK通路的

2、相關(guān)性，以闡明BK對(duì)腎纖維化的作用及其機(jī)制，為臨床腎纖維化的預(yù)防、治療提供新的思路和方法。 方法： 1．為了觀察BK不同濃度對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞的影響，系膜細(xì)胞用不同濃度的BK(0，10，100，1000ng/ml)孵育15分鐘后和高糖(30mmol/l)共同孵育48小時(shí)，用RT-PCR法檢測細(xì)胞CTGFmRNA和FNmRNA的表達(dá)。 2．為了觀察BK作用不同時(shí)間對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞的影響，用相同濃度的BK(100ng/

3、ml)孵育細(xì)胞15分鐘后和高糖(30mmol/l)共同孵育24h、48h、72h，用RT-PCR法檢測細(xì)胞CTGFmRNA和FNmRNA的表達(dá)。 3．為了觀察BK對(duì)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞磷酸化JNK蛋白的影響，用同濃度BK(100ng/ml)孵育細(xì)胞15分鐘后和高糖(30mmol/l)共同孵育30分鐘，用Western Blotting法檢測JNK磷酸化蛋白的瞬間表達(dá)。 4．用BK-B<,2>受體阻斷劑HOE-140(Iumol/

4、L)和JNK通路阻斷劑SP-600125(10umol/l)孵育細(xì)胞15min后，加入BK(100ng/ml)孵育15 min，再加入高糖(30mmol/l)，分別用RT-PCR法測CTGF mRNA及F N mRNA的表達(dá)和用Western Blotting法測磷酸化JNK蛋白的表達(dá)量。細(xì)胞分為正常葡萄糖濃度的對(duì)照組、高糖組、BK不同濃度加高糖組、BK-B<,2>受體阻斷劑加BK加高糖組、JNK通路阻斷劑加BK加高糖組。 結(jié)果

5、： 1．BK隨濃度的增加對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)CTGFmRNA的抑制作用逐漸增強(qiáng)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)：而使用BK-B<,2>受體阻斷劑后，這種抑制作用減弱，與BK加高糖組比表達(dá)量增多，但仍低于高糖組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；即BK通過B2受體不能完全抑制高糖誘導(dǎo)細(xì)胞CTGF的表達(dá)。 2．同濃度BK與高糖共同作用細(xì)胞48h、72h時(shí)，細(xì)胞CTGFmRNA的表達(dá)量均較相對(duì)應(yīng)的高糖組減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.

6、01)；BK加高糖組在24h、48h、72h表達(dá)量隨時(shí)間增加逐漸減少，組間比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；即同濃度BK在24h、48h、72h對(duì)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞CTGF mRNA的表達(dá)量有抑制的作用，抑制作用呈時(shí)間依賴性。 3．BK不同濃度加高糖組作用48h，組間比及與高糖組比，F(xiàn)NmRNA的表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；加入BK-B<,2>受體阻斷劑后，與未加入阻斷劑的BK加高糖組及高糖組比，也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；

7、即BK不同濃度在48h對(duì)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞的FNmRNA的表達(dá)量無影響。 4．BK加高糖組在24h、48h與相應(yīng)高糖組比FNmRNA的表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而72h表達(dá)量減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；BK加高糖組在72h FNmRNA表達(dá)量較24h、48h明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。72h時(shí)加入BK-B<,2>受體阻斷劑后，BK對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)FNmRNA的抑制作用減弱，但仍低于高糖組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

8、(P<0.05)。即BK在24h、48h對(duì)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生FN無明顯抑制作用，而72h有明顯抑制作用。 5．高糖組JNK磷酸化蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；BK加高糖組較高糖組減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；加入BK-B<,2>受體阻斷劑后，BK對(duì)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)JNK磷酸化蛋白的抑制作用減弱，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)：使用JNK通路阻斷劑后，JNK磷酸化蛋白表達(dá)量明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0