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文檔簡介
1、目的:
研究石斛酚、丁香酸與醛糖還原酶(aldose reductase,AR)基因、一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因的相互作用機制,從基因轉(zhuǎn)錄水平闡明石斛抗糖尿病性白內(nèi)障的作用機制。
方法:
1.采用紫外吸收光譜的全波長掃描并觀察在石斛酚、丁香酸作用前后,AR基因與iNOS基因的最大吸收峰的位置與強度的變化,并測定其結(jié)合常數(shù)。
2.利用
2、原子力顯微技術(AFM)檢測石斛酚、丁香酸對AR基因、iNOS基因分子的表面形貌、結(jié)構和高度的影響;
3.用表面增強拉曼光譜(SERS)檢測石斛酚、丁香酸與AR基因、iNOS基因在632.8nm激發(fā)波長下40cm-1-4000cm-1波段的譜峰,確定其相互作用的位點。
4.在活細胞條件下,采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(FRET)實時檢測石斛酚、丁香酸與晶狀體上皮細胞內(nèi)的AR基因、iNOS基因結(jié)合的距離以及相互作用的能量轉(zhuǎn)
3、移率。
結(jié)果:
1.石斛酚與AR基因的相互作用研究結(jié)果:通過紫外可見吸收光譜結(jié)果可以初步判斷石斛酚與AR基因的相互作用方式可能是溝槽結(jié)合,根據(jù)AR基因的最大吸收峰處的吸光度值隨著石斛酚濃度與AR基因濃度的比值變化來看,石斛酚與AR基因作用之間存在很多的結(jié)合位點,并可計算出其結(jié)合常數(shù)為1.85×103L/mol。原子力顯微技術進一步研究其相互作用,結(jié)果顯示石斛酚可以導致AR基因分子聚集纏繞,平均高度可增加0.3-0.6
4、nm,進一步印證了其相互作用模式。
2.石斛酚與iNOS基因相互作用研究:紫外光譜的結(jié)果顯示石斛酚主要通過結(jié)合到iNOS基因的大溝或小溝上與之作用。iNOS基因最大吸收峰處的吸光度值與石斛酚和iNOS基因濃度比值之間呈線性關系,表示石斛酚與iNOS基因之間存在多處結(jié)合,結(jié)合常數(shù)為7.2×102L/mol。原子力顯微鏡的表面相貌圖的變化顯示石斛酚導致iNOS基因鏈纏繞收縮、聚集,節(jié)點數(shù)增多,平均高度增加。
3.丁香酸與
5、AR基因的相互作用研究:從紫外可見吸收光譜圖可以看出AR基因的最大吸收波長隨著丁香酸的濃度增加呈現(xiàn)紅移增色現(xiàn)象,可以推斷其結(jié)合方式為溝槽結(jié)合,同樣存在較多的結(jié)合位點,結(jié)合常數(shù)為2.85×103L/mol。原子力顯微結(jié)果顯示丁香酸與AR基因結(jié)合并導致基因分子纏繞聚集,平均高度增加。表面增強拉曼光譜顯示隨著丁香酸的濃度增加,AR基因處于1493.24cm-1的拉曼譜線強度向高波數(shù)移動(1495.51cm-1),再次印證二者發(fā)生相互作用。
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