抑制乙酰膽堿酯酶對(duì)視網(wǎng)膜炎癥保護(hù)作用及機(jī)制的研究.pdf

1、多種致盲性眼病如葡萄膜炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等病理生理過(guò)程都涉及炎癥反應(yīng)。炎癥是一種非特異性的防御反應(yīng)，不僅各種各樣的分子和功能會(huì)改變，而且還發(fā)生白細(xì)胞的募集和粘附。在急性期，白細(xì)胞募集可以清除入侵的有害因素，通常導(dǎo)致組織修復(fù)。然而，如果炎癥持續(xù)，白細(xì)胞粘附及長(zhǎng)期分泌的化學(xué)介質(zhì)會(huì)損傷組織。視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)常導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織水腫、出血和滲出，可引起視力不同程度的下降。
　　研究發(fā)現(xiàn)主要集中在突觸等神經(jīng)

2、組織、可迅速水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（Acetylcholine，ACh）的乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）可作為系統(tǒng)炎癥的標(biāo)記物，其基因可以啟動(dòng) DNA結(jié)合位點(diǎn)，可能在募集核轉(zhuǎn)錄因子（Nuclear Factor-KappaB，NF-кВ）過(guò)程中參與炎癥反應(yīng)，在機(jī)體多種器官、組織、細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中呈現(xiàn)高表達(dá)；即使在腦脊液、血漿、組織中的其他炎性標(biāo)志物升高不明顯的炎癥反應(yīng)中，AChE的表達(dá)也會(huì)明顯增加；且多

3、個(gè)研究表明， AChE抑制劑在細(xì)胞水平和分子水平都有抗炎的功能，可抑制淋巴細(xì)胞增殖、促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及細(xì)胞外的酯酶的活動(dòng)。
　　本課題研究目的是明確 AChE在視網(wǎng)膜炎癥中的作用及抑制 AChE對(duì)視網(wǎng)膜炎癥的影響，并探討其中可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)使用 ARPE-19細(xì)胞系、AChE基因敲除小鼠及給予AChE抑制劑灌胃C57BL/6J小鼠，研究AChE基因及蛋白水平的變化對(duì)視網(wǎng)膜炎癥的影響，并且重點(diǎn)分析了這種影響與經(jīng)典 NF-кВ通路的

4、關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)AChE作為主要分布于神經(jīng)組織的水解酶，參與視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)，抑制 AChE可以減輕視網(wǎng)膜炎癥對(duì)視網(wǎng)膜炎癥有保護(hù)作用，并且這種作用可能是通過(guò)經(jīng)典抑制 NF-кВ經(jīng)典通路實(shí)現(xiàn)的，這將有利于我們尋找干預(yù)和治療視網(wǎng)膜炎癥的新靶點(diǎn)。
　　第一部分抑制AChE對(duì)視網(wǎng)膜炎癥的影響
　　目的：探討抑制AChE對(duì)視網(wǎng)膜炎癥的影響。
　　方法：（1）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系（ARPE-19），使用AChE抑制

5、劑（多奈哌齊）及AChE siRNA抑制AChE的表達(dá)后，利用TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥（4小時(shí)及24小時(shí)），采用細(xì)胞爬片免疫熒光及蛋白免疫印跡技術(shù)測(cè)定AChE及ICAM-1的表達(dá)情況；(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：○1取2月齡健康雌性C57BL/6J小鼠利用多奈哌齊10mg/kg或相同劑量1XPBS連續(xù)灌胃3天后1只眼給予玻璃體腔注射TNF-α1μl(50ng/ml)誘導(dǎo)動(dòng)物視網(wǎng)膜炎癥，另一只眼均給予1XPBS1μl，將視網(wǎng)膜分為Vehicle組、Ve

6、hicle+TNF-α組、Donepezil組及Donepezil+TNF-α組，24h后處死小鼠，檢測(cè)指標(biāo)同模型1?！?取2月齡健康雌性 AChE+/-和AChE+/+小鼠1只眼均給予玻璃體腔注射TNF-α1μl(50ng/ml)誘導(dǎo)動(dòng)物視網(wǎng)膜炎癥，另一只眼均給予1XPBS1μl，將視網(wǎng)膜分為AChE+/+組、AChE+/++TNF-α組、AChE+/-組、AChE+/-+TNF-α組，24h后處死小鼠，取小鼠視網(wǎng)膜或視杯，利用蛋白免

7、疫印跡及免疫熒光技術(shù)和白細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)相關(guān)炎癥指標(biāo)的表達(dá)；
　　結(jié)果：（1）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：在TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥中，AChE、ICAM-1的表達(dá)上調(diào)，當(dāng)使用多奈哌齊或AChE siRNA抑制AChE的表達(dá)后，AChE、ICAM-1的表達(dá)下調(diào)且呈最適濃度為10μM；(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：給予TNF-α玻璃體腔注射后， AChE+/-+TNF-α組AChE、ICAM-1、Albumin、CD11b的表達(dá)及白細(xì)胞粘附較AChE+/++TNF

8、-α組低、而C57BL/6J小鼠模型以上指標(biāo)，Donepezil+TNF-α組較Vehicle+TNF-α組低。
　　結(jié)論：抑制AChE對(duì)視網(wǎng)膜炎癥有保護(hù)作用。
　　第二部分抑制AChE對(duì)視網(wǎng)膜炎癥保護(hù)作用的機(jī)制研究
　　目的：探討抑制AChE對(duì)視網(wǎng)膜炎癥保護(hù)作用的機(jī)制。
　　方法：（1）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系（ARPE-19），使用AChE抑制劑（多奈哌齊）及AChE siRNA抑制AChE的

9、表達(dá)后，利用TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥（5分鐘及30分鐘），采用細(xì)胞爬片免疫熒光及蛋白免疫印跡技術(shù)及測(cè)定NF-кВ經(jīng)典通路相關(guān)抗體的表達(dá)情況；(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：方法同第一部分，采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)NF-кВ表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞爬片免疫熒光結(jié)果顯示，給予 TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥30分鐘時(shí)，NF-кВ入核表達(dá)增高，當(dāng)使用多奈哌齊或AChE siRNA后，NF-кВ入核表達(dá)降低；蛋白免疫印跡技術(shù)結(jié)果顯示，給予TNF-α誘導(dǎo)細(xì)

10、胞炎癥5分鐘及30分鐘時(shí)，p-NF-кВ、p-IKK、p-IкВα的表達(dá)上調(diào)，當(dāng)使用多奈哌齊或AChE siRNA抑制AChE表達(dá)后，以上指標(biāo)表達(dá)下調(diào)且最適劑量為10μM；(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：TNF-α玻璃體腔注射后，AChE+/-+TNF-α組NF-кВ的入核量較AChE+/++TNF-α組少、而 C57BL/6J小鼠模型中， Donepezil+TNF-α組 NF-кВ的表達(dá)較Vehicle+TNF-α組少。
　　結(jié)論：抑制ACh