基于FAK-SRC-p130Cas通路探討青娥方影響骨吸收的實驗研究.pdf

1、一、目的:
　　闡明去卵巢大鼠與FAK/Src/p130Cas系統(tǒng)及下游信號關(guān)鍵因子的關(guān)系，從破骨細胞的分化和功能調(diào)節(jié)的角度揭示青娥方防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用機制。
　　二、方法:
　　1在體實驗
　　1.1動物造模、分組、干預、取材:3月齡SPF級雌性SD大鼠120只，隨機分成4組:假手術(shù)組、單純?nèi)ヂ殉步M、去卵巢+骨疏康組和去卵巢+青娥方組，各30只。除假手術(shù)組外，其余3組行雙側(cè)卵巢結(jié)扎切除術(shù)。假手術(shù)組除未行

2、卵巢結(jié)扎切除外，其余步驟同其余3組。術(shù)后3天開始灌胃，去卵巢+骨疏康組給予骨疏康顆粒1.8g·kg-1·d-1，去卵巢+青娥方組給予青娥方浸膏0.62g·kg-1·d-1，假手術(shù)組和單純?nèi)ヂ殉步M以生理鹽水灌胃。用藥后4周、8周、12周每組分別處死10只，取血清、股骨、脛骨和腰椎骨備用。
　　1.2指標檢測:ELISA法檢測血清E2、TRAP、BALP含量和尿DPD/Cr含量以觀察骨代謝的變化;雙能X射線骨密度儀檢測右股骨頸、右脛骨

3、上段以及腰4-6椎體密度;隨后應用三點彎曲法行右股骨生物力學檢測，壓縮法行腰4椎體生物力學檢測;左股骨頸、左脛骨上段和腰3椎體制作石蠟切片，MASSON染色后行形態(tài)學分析骨小梁面積百分比;腰1椎體提取組織RNA，實時熒光定量PCR法檢測FAK/Src/p130Cas系統(tǒng)及下游信號通路關(guān)鍵因子Crk、C3G和RAS的mRNA表達。腰2椎體提取組織蛋白，Western Blot法檢測FAK/Src/p130Cas系統(tǒng)及下游信號關(guān)鍵因子Crk

4、、C3G和RAS蛋白的表達。
　　2體外實驗
　　2.1含藥血清制備:取3月齡SPF級雌性SD大鼠60只，分為青娥方組和空白組，各30只，青娥方組給予青娥方浸膏0.62g·kg-1·d-1，空白組給予生理鹽水2mL·d-1，連續(xù)灌胃7天，于最后一次灌胃后1h腹主動脈無菌取血，凝固后離心取血清備用。
　　2.2細胞培養(yǎng)和指標檢測:破骨細胞前體細胞株RAW264.7分為空白血清組和含藥血清組?？瞻捉M和青娥方組在50ng/m

5、L RANKL+30ng/mL MCSF誘導下，用梯度濃度含藥血清干預RAW264.7細胞分化成破骨細胞，以選擇最佳血清濃度。空白組和青娥方組分別加入最佳濃度空白血清和青娥方含藥血清培養(yǎng):①干預2、4、6天，觀察RAW264.7細胞的存活率;②干預12、24小時后，提取細胞上清液，應用ELISA法檢測PGE2、TNF-α和IL-6含量。RAW264.7細胞接種后分4組:空白組、青娥方組、空白+FAK抑制劑組和青娥+FAK抑制劑組，分別加

6、入最佳濃度空白血清和青娥方含藥血清以及FAK抑制劑，在50ng/mL RANKL+30ng/mL MCSF誘導下:①干預2、4、6天，觀察RAW264.7細胞分化破骨細胞;②干預12、24小時后，提取細胞RNA和蛋白，實時熒光定量PCR法和Western Blot法檢測FAK/Src/p130Cas系統(tǒng)及下游信號關(guān)鍵因子Crk、C3G和RAS的mRNA表達及蛋白的表達。
　　三、結(jié)果:
　　1、用藥后4、8、12周，單純?nèi)ヂ?/p>

7、巢組與假手術(shù)對照組相比，骨小梁纖細、斷裂、不完整，骨密度和骨生物力學指標持續(xù)下降。血清E2含量持續(xù)下降，血清TRAP、BALP含量和尿DPD/Cr含量等骨代謝指標均明顯升高，呈動態(tài)變化。用藥后4周，F(xiàn)AK、p130Cas表達緩慢升高，第8周達到最高峰，12周有所回落。用藥后4周，SRC、CRK、C3G表達急劇升高，第8、12周逐漸降低，但仍比同期假手術(shù)期高。RAS表達呈現(xiàn)升高、降低、升高的“V”形變化。
　　2、青娥方干預可明顯增

8、加去卵巢大鼠的骨密度，提高骨生物力學性能，逆轉(zhuǎn)去卵巢導致的骨代謝指標變化;降低去卵巢后骨組織FAK、SRC、p130Cas、CRK、C3G和RAS的表達。
　　3、RANKL+MCSF刺激增加破骨前體細胞FAK/SRC/ p130Cas及其下游信號分子CRK、C3G和RAS的RNA和蛋白表達，從而誘導破骨細胞分化。青娥方含藥血清能抑制破骨前體細胞的存活、分化，降低FAK/SRC/ p130Cas及其下游信號分子的RNA和蛋白表達。

9、
　　四、結(jié)論:
　　1、去卵巢大鼠術(shù)后早期FAK/SRC/p130Cas及下游分子即可出現(xiàn)高表達，隨時間推移呈現(xiàn)進一步升高或降低的不同趨勢，但均高于假手術(shù)組。其變化時間早于有意義的BMD下降或骨代謝指標，可作為絕經(jīng)后骨代謝預測和防治的參考指標。
　　2、青娥方能明顯抑制骨組織FAK/SRC/p130Cas及下游分子的高表達，改善去卵巢后骨代謝水平，從而達到防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的目的。
　　3、青娥方抑制破骨細胞前