新型金屬螯合親和反膠團(tuán)對EGFP萃取特性的研究.pdf

1、反膠團(tuán)萃取技術(shù)廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)的分離過程中，但是傳統(tǒng)的離子型反膠團(tuán)在萃取過程中往往對蛋白質(zhì)選擇性低以及使蛋白質(zhì)失活?；诖耍狙芯渴仪叭碎_發(fā)出了新型的金屬螯合親和反膠團(tuán)(MCARM)，為了驗(yàn)證此反膠團(tuán)對實(shí)際表達(dá)蛋白的萃取分離能力，本文利用MCARM對基因工程表達(dá)產(chǎn)物6×his標(biāo)記的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的萃取特性進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。
　　 首先，本文研究了MCARM對純化好的EGFP的萃取以及反萃特性。研究內(nèi)

2、容包括EGFP的萃取及反萃動力學(xué)；金屬離子濃度、pH、鹽濃度對EGFP萃取率的影響；咪唑濃度、pH和鹽濃度對EGFP反萃率的影響。結(jié)果表明，MCARM萃取EGFP的平衡時(shí)間為6 min，反萃平衡時(shí)間為120 min。當(dāng)鎳離子濃度為2mmol/L，萃取的操作pH為7～9，鹽濃度為0.1 mol/L時(shí)，可將濃度為0.5 mg/mL的EGFP的萃取率達(dá)到90％以上。當(dāng)反萃液中咪唑濃度為500 mmol/L，pH在8～10之間，鹽濃度為0.1

3、mol/L時(shí)，EGFP的反萃率達(dá)到90％以上，所得產(chǎn)物具有熒光活性。驗(yàn)證了MCARM對EGFP具有高萃取率和高反萃率。
　　 在上述工作基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步利用該反膠團(tuán)直接從表達(dá)菌的破菌上清液中純化可溶表達(dá)的EGFP。從上樣蛋白質(zhì)濃度、反膠團(tuán)中鎳離子濃度以及萃取次數(shù)等方面對EGFP的純化條件進(jìn)行了優(yōu)化，并最終與金屬螯合色譜進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，料液蛋白濃度為0.6 mg/mL，上樣量為4 mL，反膠團(tuán)中鎳離子濃度為3mmol/L時(shí)