非小細(xì)胞肺癌患者血液循環(huán)DNA含量及完整性的研究.pdf

1、（一）免提取cfDNA含量及完整性檢測方法建立及性能評價
　　背景
　　非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最常見的類型，包括腺癌，鱗癌，細(xì)支氣管肺泡癌和大細(xì)胞癌。大約70％的患者在確診時，已是晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，不能得到很好的治療，所以盡早發(fā)現(xiàn)非常重要。腫瘤患者血液中的游離DNA（cell free DNA，cfDNA）包括循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），主要來源于細(xì)胞的凋亡和壞死。血液循環(huán)中的癌細(xì)胞

2、和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞同樣釋放cfDNA，可以通過檢測cfDNA含量來估算腫瘤負(fù)荷、評價治療效果。DNA的完整性（Integrity）有別于非腫瘤人群是腫瘤患者cfDNA的另一個顯著特征。目前定量常用PCR方法，第一步需要提取血液循環(huán)DNA，這是一個極容易產(chǎn)生誤差的步驟。即便不考慮操作者的因素，提取方法和試劑的不同就會造成巨大誤差。
　　目的
　　研究一種方法，不經(jīng)過DNA提取步驟，直接對血液中的循環(huán)DNA進(jìn)行定量，可以去除DN

3、A提取試劑盒和操作人員差異造成的DNA提取誤差。
　　方法
　　通過提取和免提取cfDNA直接定量的兩種方法來對比檢測cfDNA，比較兩者的擴(kuò)增效率，精密度及準(zhǔn)確度。
　　結(jié)果
　　我們通過特殊的技術(shù)工藝處理，可以直接用血清進(jìn)行定量PCR，不影響PCR反應(yīng)，擴(kuò)增效率與提純DNA一致，可精確檢測出低至ng水平的血清游離DNA，檢測范圍1-10000ng/ml，本方法具有較高的準(zhǔn)確度及精密度。相比先用試劑盒提取cfD

4、NA，在定量結(jié)果的穩(wěn)定性、重復(fù)性等方面都有顯著改善。
　?。ǘ┓切〖?xì)胞肺癌患者cfDNA含量及完整性的研究
　　背景
　　近年來，血液循環(huán)DNA(cfDNA)作為一種潛在的腫瘤標(biāo)志物已經(jīng)受到越來越多人的關(guān)注，因?yàn)樗臋z測創(chuàng)傷很小而且方便，所以比較容易被人們接受。cfDNA的水平在健康人和良性疾病病人中較低，但是在非小細(xì)胞肺癌患者的血液中有非常明顯的增加。癌癥病人的循環(huán)腫瘤DNA的完整性也是其重要特征之一。因此聯(lián)合cf

5、DNA的含量和完整性可能是診斷癌癥的一個很好的指標(biāo)。
　　目的
　　通過比較非小細(xì)胞肺癌患者和健康人的循環(huán)DNA的含量及完整性，來評價循環(huán)DNA含量及完整性用于診斷NSCLC的臨床價值。
　　方法
　　采用本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)立的免提取血液循環(huán)DNA含量及完整性檢測的PCR技術(shù)，對非小細(xì)胞肺癌患者及健康人的循環(huán)DNA進(jìn)行定量，分析比較兩組的區(qū)別。
　　結(jié)果
　　1. NSCLC病人組及健康對照組的cfDNA含量

6、中位數(shù)（四分位距）分別為212(622.25) ng/ml和65.4(290.65) ng/ml，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；而完整性指數(shù)（DII）的中位數(shù)（四分位距）分別是0.0764(0.276)和0.066(0.186)，兩組之間的差異無顯著性，P>0.05。
　　2. cfDNA含量和完整性指數(shù)（DII）在不同性別、年齡及腫瘤病理類型間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均大于0.05；而在不同病理分期的組間差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、意義，P<0.05。
　　3.循環(huán)DNA含量用來區(qū)分NSCLC患者和健康人群的AUC是0.659，此時的敏感性為72.3%，特異性為59.5%，cut-off值為87.5 ng/ml。
　?。ㄈ┓切〖?xì)胞肺癌組織EGFR信號途徑相關(guān)基因突變的檢測
　　背景
　　目前，與NSCLC靶向治療相關(guān)幾個信號途徑已經(jīng)被研究多年，其中最主要的是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor

8、，EGFR）信號途徑，針對該途徑研制開發(fā)的酪氨酸酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI），常用的藥物有厄洛替尼，吉非替尼，西妥昔單抗等，都在臨床上取得了不錯的療效。EGFR信號通路中，EGFR、KRAS、PIK3等基因是否存在缺失、重排或點(diǎn)突變，都可以顯著影響上述靶向藥物療效。所以，臨床上在應(yīng)用靶向藥物之前，常規(guī)都會進(jìn)行相關(guān)靶點(diǎn)基因的檢測。
　　目的
　　對臨床上非小細(xì)胞肺癌患者經(jīng)常發(fā)生的EGF

9、R信號途徑相關(guān)基因突變進(jìn)行檢測，分析患者的突變情況與臨床因素之間的聯(lián)系。
　　方法
　　采集手術(shù)時NSCLC患者新鮮腫瘤組織，提取基因組DNA，經(jīng)過特異性引物擴(kuò)增后，用焦磷酸測序檢測待測突變。
　　結(jié)果
　　1.56名患者腫瘤組織中，共有9名檢出EGFR19外顯子缺失突變，8名檢出21外顯子L858R堿基替換，1名檢出18外顯子G719S/C突變；還有2名檢出KRAS第12密碼子突變，1名檢出PIK3CA的E54

10、5K點(diǎn)突變。綜合看來，EGFR的突變率為32.14%， KRAS的突變率為3.57%，PIK3CA突變率為1.79%。
　　2. NSCLC患者腫瘤組織的EGFR的突變率在不同病理分期、病理類型之間有顯著性差異，P<0.05。
　　結(jié)論
　　1.免提取cfDNA定量PCR方法，具有較高的準(zhǔn)確度及精密度，線性范圍能夠達(dá)到1-10000ng/ml，與試劑盒提取法相比，在定量結(jié)果穩(wěn)定性、重復(fù)性等方面都有顯著改善。
　　

11、2.基于LINE1基因的免提取定量PCR方法，能夠很好地對NSCLC病人的血液循環(huán)DNA含量及完整性進(jìn)行測定。
　　3.非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)DNA含量顯著高于健康人；NSCLC病人cfDNA含量、完整性指數(shù)（DII）與患者的病理分期相關(guān)，分期越早，含量及完整性越低，提示檢測此標(biāo)志物水平有助于評估疾病的嚴(yán)重程度；cfDNA含量用于診斷NSCLC的靈敏度是72.3%，特異度是59.5%，cut-off值為87.5 ng/ml，此時RO