費(fèi)氏中華根瘤菌HN01 smrA所在基因簇的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)及調(diào)控初步研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室利用轉(zhuǎn)座子突變法從費(fèi)氏中華根瘤菌}tN01基因組中篩選到一個(gè)與硫代謝相關(guān)并影響菌株結(jié)瘤能力和結(jié)瘤時(shí)間的基因smrA。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)在smrA的上游有4個(gè)轉(zhuǎn)錄方向相同的基因即ORFa、ORFb、ORFc、ORFd和一個(gè)共同的啟動(dòng)子序列，而在該基因的下游是另外一個(gè)具有相同轉(zhuǎn)錄方向的基因ORFe。在ORFd和ORFe之間也存在可能的啟動(dòng)子序列。本工作的目的一是驗(yàn)證smrA基因是否與其它基因共同組成一個(gè)操縱子；二是研究硫?qū)υ摬倏v子表達(dá)

2、調(diào)控的影響。 首先對(duì)兩個(gè)可能的啟動(dòng)子區(qū)域P1和P2的啟動(dòng)子活性進(jìn)行了研究。根據(jù)測(cè)序的結(jié)果設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到了ORFa的ATG上游297 bp長(zhǎng)的P1片段和ORFe上游321 bp長(zhǎng)的P2片段。通過(guò)融合PCR將這兩個(gè)片段分別融合到無(wú)啟動(dòng)子的gus基因上游。將這兩個(gè)融合片段插入質(zhì)粒載體pTR102，通過(guò)三親本結(jié)合法導(dǎo)入費(fèi)氏中華根瘤菌HN01中。對(duì)這兩個(gè)重組根瘤菌進(jìn)行GUS活性檢測(cè)以驗(yàn)證導(dǎo)入片段的啟動(dòng)子活性，結(jié)果表明P1和P

3、2片段都具有啟動(dòng)子功能，從而說(shuō)明了smrA基因所在操縱子包括了ORFa、ORFb、ORFc和ORFd，但不包括ORFe。通過(guò)研究硫源對(duì)P1片段啟動(dòng)子活性的影響發(fā)現(xiàn)，在添加有碳源和氮源的MM培養(yǎng)基中，啟動(dòng)子活性最高，而在添加了碳、氮、硫源(硫源分別為Na<,2>SO<,4>、Na<,2>SO<,3>、Na<,2>S<,2>O<,3>和Met)的MM培養(yǎng)基中，啟動(dòng)子活性均有明顯降低，推測(cè)硫?qū)1片段的啟動(dòng)子活性有抑制作用。對(duì)P1片段進(jìn)行5’