根瘤菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中l(wèi)uxI-luxR類(lèi)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究.pdf

1、群體感應(yīng)是指細(xì)菌通過(guò)向周?chē)h(huán)境中釋放可自由擴(kuò)散的小分子量的自體誘導(dǎo)物來(lái)監(jiān)測(cè)自身細(xì)胞濃度及周?chē)渌?xì)菌數(shù)量變化，調(diào)控下游特定基因的表達(dá)及相關(guān)生理活動(dòng)的一種行為。不同的群體感應(yīng)系統(tǒng)之間都有一定的聯(lián)系，它們之間有著十分復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而引起物種之間的多樣性。目前，在很多根瘤菌中都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了群體感應(yīng)系統(tǒng)，其中研究的十分透徹的是豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum bv.viciae），由于它同時(shí)包含四個(gè)群體感應(yīng)系統(tǒng)（ci

2、n, rai, rhi和tra），因此具有相對(duì)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。但對(duì)菜豆根瘤菌Rhizobium etli CFN42的群體感應(yīng)系統(tǒng)尚未有詳細(xì)的報(bào)道。
　　本文主要以菜豆根瘤菌（Rhizobium etli CFN42）作為研究對(duì)象，通過(guò)查閱MicrobesOnline數(shù)據(jù)庫(kù)，以及對(duì)R.etli CFN42基因組序列進(jìn)行詳細(xì)的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)R.etliCFN42菌株中至少含有3種luxI家族同源的AHL類(lèi)自體誘導(dǎo)物合成酶基因，它們分別被

3、命名為cinI, raiI和traI;同時(shí)還包括4種luxR家族同源的調(diào)控基因，它們分別被命名為cinR, raiR, traR1和traR2。通過(guò)與pRA302質(zhì)粒進(jìn)行融合，構(gòu)建Pluxl-lacZ和PluxR-lacZ的啟動(dòng)子翻譯融合表達(dá)質(zhì)粒，將這些重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到野生型菌株及l(fā)uxI/luxR缺失株中，質(zhì)粒上報(bào)告基因lacZ表達(dá)的強(qiáng)弱直接反映出該基因啟動(dòng)子被激活的強(qiáng)度。研究發(fā)現(xiàn)，cinI的表達(dá)嚴(yán)格依賴(lài)cinR的調(diào)控，raiI的表達(dá)

4、嚴(yán)格依賴(lài)raiR的調(diào)控，traI表達(dá)嚴(yán)格依賴(lài)traR1traR2的調(diào)控。
　　將cinI, raiI和traI全基因片段分別克隆到具有Ptac啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒pYC12上，電擊轉(zhuǎn)化到DH5αλpir中，實(shí)現(xiàn)cinI, raiI和traI的超表達(dá)，產(chǎn)生的CinI，RaiI和TraI合成酶，它們會(huì)合成大量的自體誘導(dǎo)物AHLs。
　　在cinI, raiI, traI基因缺失株中，分別電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入翻譯融合質(zhì)粒PcinI-lacZ,

5、PratI-lacZ和PtraI-lacZ。在培養(yǎng)過(guò)程中，分別加入構(gòu)建在DH5αλpir中三種LuxI類(lèi)蛋白表達(dá)產(chǎn)生的AHLs進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。發(fā)現(xiàn)CinI產(chǎn)生的AHLs可以誘導(dǎo)所有翻譯融合重組質(zhì)粒中報(bào)告基因lacZ的表達(dá)。
　　將cinR, raiR和traR1 traR2全基因片段分別克隆到具有Ptac啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒pYC12上，電擊轉(zhuǎn)化至R.etli相關(guān)缺失株中，完成cinR, raiR和traR1traR2基因的功能回補(bǔ)。培

6、養(yǎng)過(guò)程中，分別加入構(gòu)建在DH5αλpir中三種LuxI類(lèi)蛋白表達(dá)產(chǎn)生的AHLs誘導(dǎo)luxI-lacZ的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，猜測(cè)只有CinI產(chǎn)生的AHLs能夠與CinR、RaiR和TraR1TraR2三種調(diào)控蛋白結(jié)合誘導(dǎo)cinI-lacZ, raiI-lacZ和traI-lacZ表達(dá)，而RaiI產(chǎn)生的AHLs只能與RaiR調(diào)控蛋白結(jié)合誘導(dǎo)raiI-lacZ的表達(dá)，同樣TraI產(chǎn)生的AHLs也只能與TraR1TraR2調(diào)控蛋白結(jié)合誘導(dǎo)traI-

7、lacZ的表達(dá)。
　　總而言之，R.etli CFN42群體感應(yīng)系統(tǒng)中cin系統(tǒng)處于rai系統(tǒng)和tra系統(tǒng)的頂端，cinR是組成型表達(dá)。在自體誘導(dǎo)物合成酶基因缺失誘導(dǎo)的情況下，cinI仍有一定的本底水平表達(dá)，猜測(cè)R.etli CFN42中cinR調(diào)控cinI表達(dá)可能不依賴(lài)于CinI產(chǎn)生的AHLs，對(duì)于這個(gè)結(jié)論尚需更進(jìn)一步的研究才能確認(rèn)。
　　本文還研究了糖類(lèi)對(duì)中慢生華癸根瘤菌（Mesorhizobium huakuaii）A