費(fèi)氏中華根瘤菌HN01中putA基因的研究.pdf

1、脯氨酸氧化成谷氨酸過(guò)程中需要兩種酶的催化：脯氨酸脫氫酶（PDH）和5-二氫吡咯羧酸脫氫酶（P5CDH）。在根瘤菌中，．這兩種酶是由putA基因編碼的。本工作通過(guò)分子生物學(xué)的方法克隆到了快生型費(fèi)氏中華根瘤菌HN01中的putA基因。生物信息學(xué)分析表明，該基因與已報(bào)道的苜蓿中華根瘤菌Rm1021的putA基因相比，在核苷酸水平上有85％的同源性，在氨基酸水平上有87％的同源性。
　　 通過(guò)融合PCR的方法在putA基因潛在的啟動(dòng)子區(qū)

2、域下游導(dǎo)入無(wú)啟動(dòng)子的gus報(bào)告基因，再將這個(gè)融合片段插入載體pLAFR6構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，然后導(dǎo)入費(fèi)氏中華根瘤菌HN01中，并對(duì)這個(gè)重組根瘤菌進(jìn)行GUS活性檢測(cè)，結(jié)果表明，該基因啟動(dòng)子的表達(dá)受脯氨酸誘導(dǎo)，當(dāng)脯氨酸的濃度達(dá)到500μM時(shí)，啟動(dòng)子活性最高。
　　 通過(guò)自殺質(zhì)粒pK18mob同源單交換的方法構(gòu)建了putA基因的非極性突變體GXHNPA和極性突變體GXHNPB。通過(guò)對(duì)突變體進(jìn)行生長(zhǎng)影響的測(cè)試，發(fā)現(xiàn)突變體在以脯氨酸為唯一碳、氮