胸腺來源的iNKT 細(xì)胞對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型小鼠Th1-Th2-Th17 亞群及細(xì)胞因子的影響研究.pdf

1、目的：為了探究iNKT細(xì)胞對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）免疫平衡狀態(tài)的影響，我們構(gòu)建了RA小鼠模型，檢測(cè)iNKT細(xì)胞頻率，Th1/Th2/Th17亞群和細(xì)胞因子。并在體外誘導(dǎo)胸腺淋巴細(xì)胞向iNKT細(xì)胞分化，過繼輸注細(xì)胞至RA小鼠，探究iNKT細(xì)胞對(duì)RA小鼠的干預(yù)作用；對(duì)Th1/Th2/Th17免疫失衡的影響；并探討iNKT細(xì)胞對(duì)RA的影響機(jī)制，為今后RA發(fā)病機(jī)制和治療方法的探究提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.構(gòu)建類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

2、小鼠模型及鑒定
　　hGPI325-339、hGPI469–483多肽片段1:1混合，與完全弗氏佐劑充分乳化后，于DBA/1小鼠尾根部多點(diǎn)皮下注射，百日咳毒素0h、48h腹腔注射加強(qiáng)免疫進(jìn)行造模。
　　以健康小鼠為對(duì)照，觀察小鼠體重變化、足踝關(guān)節(jié)紅腫情況；足踝關(guān)節(jié)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining， HE）染色觀察炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況；流式細(xì)胞技術(shù)（Fluorescence-activated ce

3、ll sorting，F(xiàn)ACS）檢測(cè)外周血、脾臟iNKT細(xì)胞頻率和Th1/Th2/Th17亞群比率，微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)（Cytometric Bead Array，CBA）檢測(cè)血清細(xì)胞因子IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A、IL-2、IL-6的水平變化。
　　2.胸腺來源的iNKT細(xì)胞的誘導(dǎo)及免疫生物學(xué)功能檢測(cè)
　　分離DBA/1小鼠胸腺，獲取淋巴細(xì)胞懸液，添加IL-2、IL-4、α-Ga

4、lCer，體外刺激誘導(dǎo)iNKT細(xì)胞。一周后，免疫磁珠分選技術(shù)（Magnetic Cell Sorting，MACS）分離iNKT細(xì)胞，F(xiàn)ACS檢測(cè)iNKT細(xì)胞頻率、細(xì)胞亞群情況，CBA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平。用細(xì)胞膜深紅色熒光探針（DiR）染色細(xì)胞，尾靜脈過繼輸注至正常小鼠，小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀察細(xì)胞分布，并對(duì)小鼠體重、皮毛、皮膚、活動(dòng)和姿勢(shì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定其輸注的安全性。
　　3.觀察胸腺來源的iNKT細(xì)胞對(duì)RA小鼠的Th1

5、/Th2/Th17的影響
　　應(yīng)用胸腺來源的iNKT細(xì)胞對(duì)RA模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，以α-GalCer作為陽性對(duì)照，觀察各組小鼠體重變化和足踝關(guān)節(jié)腫脹變化情況；關(guān)節(jié)組織HE染色法觀察炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況的變化；FACS檢測(cè)iNKT細(xì)胞頻率和細(xì)胞亞群變化，CBA法檢測(cè)各組小鼠各期血清中細(xì)胞因子水平變化。
　　結(jié)果：
　　1.RA模型小鼠較健康對(duì)照組體重增長(zhǎng)緩慢（P＜0.05）；RA模型小鼠在造模第7天，足趾最先出現(xiàn)紅腫，在造模第1

6、4天紅腫達(dá)到高峰，后逐漸緩解；HE觀察發(fā)現(xiàn)足踝關(guān)節(jié)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。炎癥高峰期iNKT細(xì)胞頻率下降明顯（P＜0.05）；炎癥早期Th1和Th17亞群上升明顯（P＜0.05），炎癥中后期Th2亞群上升明顯（P＜0.05）；炎癥高峰期血清中TNF-α、IFN-γ、IL-17A、IL-2、IL-6水平顯著升高（P＜0.05）；RA小鼠iNKT頻率與TNF-α、IL-6、Th1亞群水平呈負(fù)相關(guān)。
　　2.胸腺淋巴細(xì)胞以CD4+CD8+細(xì)胞

7、為主，體外刺激誘導(dǎo)一周后，iNKT細(xì)胞頻率為7.07％?1.12%，經(jīng)純化后頻率為63.37%?5.84%。分離后的細(xì)胞以Th2細(xì)胞為主，受刺激后主要分泌IL-4。細(xì)胞輸注至正常小鼠后多分布在肝臟、脾臟，小鼠各項(xiàng)評(píng)分正常。
　　3.α-GalCer和細(xì)胞輸注均可顯著改善RA模型小鼠體重增長(zhǎng)緩慢、關(guān)節(jié)腫脹情況（P＜0.05）；足踝關(guān)節(jié)炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少；iNKT細(xì)胞頻率上升；Th1/Th2/Th17亞群及細(xì)胞因子紊亂現(xiàn)象得到一定糾正。<

8、br>　　結(jié)論：
　　1.GPI混合肽段誘導(dǎo)的RA模型小鼠在iNKT細(xì)胞和Th1/Th2/Th17細(xì)胞免疫病理方面與RA患者較為接近，可作為RA免疫機(jī)制研究和治療的良好工具。
　　2.胸腺雙陽性T細(xì)胞可體外誘導(dǎo)為iNKT細(xì)胞，為iNKT細(xì)胞發(fā)育的研究及以iNKT為中心的細(xì)胞療法的建立提供了參考。
　　3.細(xì)胞輸注通過糾正RA小鼠體內(nèi)Th1/Th2Th17亞群及細(xì)胞因子免疫平衡紊亂，維持免疫耐受，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，具有潛