膠原蛋白誘導性關(guān)節(jié)炎小鼠Th1-Th2細胞及其細胞因子的動態(tài)研究.pdf

1、類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性全身炎癥性疾病,以外周關(guān)節(jié)持續(xù)性和進行性滑膜炎,繼而引起不同程度軟骨破壞和骨侵蝕,造成關(guān)節(jié)畸形和強直為主要臨床表現(xiàn),屬于自身免疫性疾病,70％~80%患者最終可發(fā)展成不同程度的功能障礙,甚至殘疾。目前我國RA患者人數(shù)多達400多萬,是目前造成我國人民喪失勞動力主要原因之一。RA的病因及發(fā)病機制尚不明確,感染、環(huán)境、遺傳和免疫等因素共同發(fā)揮作用。近些年隨著免疫學的進展

2、發(fā)現(xiàn):CD4+T細胞中的Th1/Th2亞群參與RA免疫應答的各個階段,在RA發(fā)病機制及疾病進程中起重要作用,但報道的結(jié)果卻不盡相同。
　　目的:
　　通過建立膠原蛋白誘導性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠模型觀察Thl和Th2細胞亞群在CIA整個病程演變中的動態(tài)變化,深入探討Th1/Th2細胞及其分泌的細胞因子在 RA致病機制中的意義,為RA的治療提供一定的理論依據(jù)。
　　方法

3、:
　　1分兩批購買SPF級雄性DBA1/J小鼠,每批90只,其中42只為正常對照組,其余48只建立CIA模型。每批按隨機數(shù)字表法隨機分7個時間點(初次免疫后第7天、14天、21天、28天、35天、42天、56天),每個時間點再按隨機數(shù)字表法分正常對照組6只,CIA模型組6只。
　　2每個時間點常規(guī)無菌摘眼球取血分離血清,Flowcytomix法檢測血清中Th1型細胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2)和Th2型細胞因子

4、(IL-4、IL-5、IL-6)水平。
　　3每個時間點常規(guī)無菌摘眼球取血后處死小鼠,解剖取出脾臟制備成單細胞懸液,應用流式細胞術(shù)檢測小鼠脾臟Th1、Th2細胞數(shù)量。
　　4每個時間點常規(guī)無菌摘眼球取血后處死小鼠,解剖取出脾臟制備成單細胞懸液,應用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測Th1細胞特異性基因T-bet和Th2細胞特異性基因GATA的表達水平。
　　5采用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(`

5、x±S)表示,兩兩比較用t檢驗。以α=0.05為顯著性檢驗水準。
　　結(jié)果:
　　1流式細胞術(shù)檢測Th1、Th2細胞
　　與同期正常對照組比較,CIA小鼠脾臟Th1細胞百分率在初次免疫后第7天和第14天均明顯增高(P<0.01),第21天與正常組無顯著性差異(P>0.05),第28天 Th1細胞百分率又顯著升高(P<0.01),第35天Th1細胞百分率降低到正常組水平(P>0.05),第42天Th1細胞百分率繼續(xù)降低,

6、與正常組比較有顯著性差異(P<0.01),第56天Th1細胞百分率與正常組無顯著性差異(P>0.05)。
　　與同期正常對照組比較,CIA小鼠脾臟Th2細胞百分率在初次免疫后第7天和第14天均高于正常組(P<0.01),第21天和第28天與正常對照組比較無明顯差異(P>0.05),第35天和第42天Th2細胞百分率有升高趨勢,均明顯高于正常對照組水平(P<0.01),而到第56天降低到正常對照組水平(P>0.05)。
　　2

7、實時熒光定量PCR檢測Th1細胞特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Th2細胞特
　　異轉(zhuǎn)錄因子GATA的基因表達。
　　與同期正常對照組比較,CIA小鼠脾臟在初次免疫后第7天和第14天T-bet表達水平均明顯增高(P<0.05),而第21天T-bet表達水平下降與正常組無顯著性差異(P>0.05),第28天T-bet表達水平又開始升高(P<0.05),初免第35天T-bet表達水平與正常組比較無顯著性差異(P>0.05),第42天T-

8、bet表達水平開始下降(P<0.05),第56天T-bet表達水平與正常組無顯著性差異(P>0.05)。
　　與同期正常對照組比較,CIA小鼠脾臟在初次免疫后第7天GATA表達水平與正常對照組無明顯區(qū)別(P>0.05),至第14天GATA表達開始增高(P<0.05),第21天和第28天GATA表達下降至正常水平(P>0.05),而初次免疫第35天、第42天和56天GATA表達有上升趨勢,與正常組比較差異顯著(P<0.05)。

9、>　　3 Th1、Th2細胞型因子的動態(tài)觀察
　　3.1 Th1型因子的動態(tài)觀察
　　CIA模型組小鼠血清IFN-γ水平在初次免疫后第7天與正常組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05),第14天明顯高于正常對照組(P<0.01),第21天與正常組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05),至初次免疫第28天IFN-γ水平達最高峰,顯著高于正常組(P<0.01),而第35天IFN-γ水平雖有所下降,但仍高于正常組(P<0.05),第42天和5

10、6天逐漸下降到正常組水平(P>0.05)。
　　CIA模型組小鼠血清TNF-α水平在初次免疫后第7天、14天升高明顯,與正常對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05),第21天與正常對照組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05),至初次免疫后第28天和35天TNF-α明顯升高(P<0.05),尤其28天上升更為顯著(P<0.01),初次免疫后第42天和56天TNF-α與正常對照組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　3.2 Th2細胞

11、型因子的動態(tài)觀察
　　CIA模型組小鼠血清IL-4水平在初次免疫后第7天、14天均高于正常組且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05),第21天下降至正常組水平(P>0.05),初免后第28天IL-4顯著高于正常組水平(P<0.01),至第35天、42天和56天與正常組比較均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　CIA模型組小鼠血清IL-5只在初次免疫后第7天明顯高于正常對照組水平且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但第14天、21天