黃連堿合成工藝優(yōu)化及其抗氧化活性分析.pdf

1、氧化應(yīng)激是機體產(chǎn)生過量的活性氧（ROS）并且超出其自身抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力，氧化和抗氧化失衡的一種病理狀態(tài)。大量的ROS將會攻擊生物大分子，造成脂質(zhì)過氧化損傷、蛋白損傷、DNA損傷以及隨后的細胞凋亡。氧化應(yīng)激對細胞組織造成的功能性損傷，在一定程度上與人類系統(tǒng)性疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，極可能導致心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病和癌癥等疾病的產(chǎn)生。因此，正如高血糖、高甘油三酯和高膽固醇等人類代謝性疾病的高危因素一

2、樣，氧化應(yīng)激給人類健康帶來嚴重影響，尋找抗氧化活性物質(zhì)對于人類慢性疾病的控制和改善顯得尤為重要。黃連是最常用傳統(tǒng)中藥的前50味之一，在中醫(yī)治療中，其運用具有悠久的歷史。黃連的主要活性成分是小檗堿，黃連堿，巴馬汀，表小檗堿以及藥根堿，這五種生物堿均屬于異喹啉類衍生物，僅存在取代基的不同，具有相似的化學結(jié)構(gòu)，所以其生理活性也大致相似。其中，黃連堿呈現(xiàn)出多種藥理活性，包括：抗菌、保護胃黏膜,抗高膽固醇血癥,抗高甘油三酯血癥,抗肥胖和抗氧化。有

3、關(guān)黃連堿的抗氧化活性，僅僅報道了其在體外的自由基清除活性以及體內(nèi)對氧化應(yīng)激標志物的改變，但是黃連堿對氧化應(yīng)激動物模型的病理狀態(tài)的抵抗作用以及抗氧化潛在機制仍然不清楚。因此，本課題旨在進一步探究黃連堿的抗氧化活性及其潛在的作用機制，為黃連的綜合開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。同時，對黃連堿的活性研究需要進行材料準備，本課題旨在采用化學合成的方法來批量生產(chǎn)黃連堿，通過優(yōu)化合成工藝，提高黃連堿合成收率并得到高純度的終產(chǎn)物，作為其藥理活性研究的原料來源。

4、
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴以2,3-二羥基苯甲醛為起始原料，經(jīng)環(huán)合、縮合和閉環(huán)三步反應(yīng)得到目標化合物黃連堿。主要的優(yōu)化在于第二步反應(yīng)采用甲醇重結(jié)晶法代替硅膠柱層析法進行分離純化，以及第三步設(shè)計不同酸性性質(zhì)和酸性強度的反應(yīng)介質(zhì)，從而篩選得到最佳反應(yīng)條件，顯著提高了黃連堿全合成的收率，縮短了反應(yīng)時間，并在最后的純化操作省去了調(diào)pH的操作。我們最終選擇甲酸加5％的磷酸（甲酸體積：磷酸體積=1：5%）作為最后一步的反應(yīng)溶劑，于90℃反應(yīng)

5、3小時得產(chǎn)量較高的黃連堿，總收率由原文獻的13.7%提高到43.0%，且純度高達98.5%。⑵探究黃連堿對AAPH誘導的氧化應(yīng)激斑馬魚胚胎的抗氧化作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激誘導劑AAPH顯著增加斑馬魚胚胎的ROS產(chǎn)生、心跳速率、脂質(zhì)過氧化和細胞死亡。然而給予黃連堿治療后，發(fā)現(xiàn)其針對這些病理狀態(tài)具有良好的抵抗作用。尤其是高劑量黃連堿能有效減少ROS產(chǎn)生、降低心跳速率、抑制脂質(zhì)過氧化和細胞死亡，其抵抗作用使得各指標分別較模型組顯著降低了41.3

6、%（P＜0.01），24.9%（P＜0.01），26.5%（P＜0.01），30.0%（P＜0.01）。⑶采用qRT-PCR方法，探索黃連堿對AAPH誘導的氧化應(yīng)激斑馬魚胚胎的抗氧化機制中發(fā)現(xiàn)，AAPH誘導的氧化應(yīng)激使得斑馬魚胚胎中抗氧化相關(guān)基因（NQO1、Nrf2、Akt、JNK、p38和ERK）的mRNA表達較正常組顯著降低。然而10μg/mL的高劑量黃連堿作用后，能夠顯著上調(diào)抗氧化相關(guān)基因的表達。與模型組相比，NQO1、Nrf2、

7、Akt、JNK、p38和ERK的mRNA表達分別被黃連堿提高了44.9%(P＜0.05)，75.8%(P＜0.01)，50.0%(P＜0.01),31.1%(P＜0.01)，16.3%(P＜0.05)和34.7%(P＜0.01)。這說明黃連堿能夠在轉(zhuǎn)錄水平上增加抗氧化相關(guān)靶標的基因表達，從而發(fā)揮抗氧化活性。⑷探究黃連堿對AAPH誘導的HepG2細胞氧化應(yīng)激的抗氧化作用。結(jié)果顯示，AAPH的刺激導致了HepG2細胞中ROS顯著增加、GSH

8、含量顯著減少、SOD和GPx活力顯著降低。而黃連堿能夠較顯著抑制ROS的產(chǎn)生，提高內(nèi)源性抗氧化劑GSH含量以及抗氧化酶SOD和GPx的活力，從而發(fā)揮抗氧化活性。高劑量黃連堿降低ROS、增加GSH含量以及提高SOD和GPx活力分別較模型組達40.1%（P＜0.01），19.8%（P＜0.01），18.3%（P＜0.05），49.3%（P＜0.01）。⑸采用western blot法，進一步探討了黃連堿對AAPH誘導的HepG2細胞氧化應(yīng)激

9、的抗氧化機制。數(shù)據(jù)顯示，處于氧化應(yīng)激的HepG2細胞，其NQO1、Nrf2、p-Akt和p-JNK的蛋白表達水平較正常組顯著降低，而高劑量黃連堿干預后，上述靶標的蛋白表達分別較模型組極顯著地上調(diào)了117.2%，34.6%，358.8%，221.1%。同時，高劑量黃連堿能促進Nrf2的核遷移。我們得出，黃連堿通過促使Akt和JNK信號的磷酸化來激活這兩種上游靶標，也通過促進Nrf2的蛋白表達和核遷移來激活Nrf2及其后續(xù)的信號轉(zhuǎn)導，最終誘