酸性環(huán)境對慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，慢性腎臟?。–KD）發(fā)病率逐年升高，目前成為了世界性難題，研究顯示心血管疾?。–VD)成為CKD患者首位死因，而血管鈣化是心血管疾病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。血管中膜鈣化是CKD患者血管鈣化的主要特征。血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）作為血管中膜的重要組成成分，研究發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境可以抑制血管中膜鈣化，但其具體機(jī)制尚不明確。本研究探討酸性環(huán)境對慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的影響及可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)分組

2、和模型構(gòu)建
　　1.1以行5/6腎切除術(shù)來構(gòu)建大鼠慢性腎衰竭的模型，再通過飼喂骨化三醇引起大鼠血管鈣化的發(fā)生，飼喂NH4CL構(gòu)建大鼠的慢性代謝性酸中毒的模型。將22只健康雄性SD大鼠，將大鼠隨機(jī)分成4組，即假手術(shù)組（sham；n=6）、慢性腎衰竭組（CKD；n=5）、鈣化組（CKD+VC；n=5）和酸干預(yù)組（CKD+VC+AC；n=6）。于大鼠的腹主動(dòng)脈穿刺采血，血?dú)夥治鰷y定動(dòng)脈血pH，動(dòng)脈血用肝素抗凝，離心后，分離血漿，-80℃

3、凍存?zhèn)溆?。取大鼠胸腹主?dòng)脈全長，用于組織學(xué)觀察和鈣含量測定。
　　1.2體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用10mMβ-甘油磷酸誘導(dǎo)VSMCs鈣化，依據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大鼠血?dú)夥治鼋Y(jié)果，酸干預(yù)大鼠動(dòng)脈血?dú)?pH值為7.143±0.163，體外實(shí)驗(yàn)為更好模擬體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，選定酸干預(yù)組pH值為7.1。將VSMCs隨機(jī)分為4組：（1）正常+pH7.4組;（2）高磷+pH7.1組;（3）高磷+pH7.4組;（4）維拉帕米干預(yù)組。
　　2.大鼠標(biāo)本采集與處理:5周之后

4、用2％戊巴比妥鈉30mg/kg予大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈穿刺，應(yīng)用血?dú)夥治鰞x檢測動(dòng)脈pH、[HCO3-]濃度，同時(shí)采血用Unicel Dxc800全自動(dòng)生化分析儀檢測大鼠血肌酐（Scr）、尿素氮(BUN)。摘取胸主動(dòng)脈全段：上段組織保存于液氮用于鈣含量檢測；下段用10％甲醛固定后石蠟包埋行鈣化染色及 runx2和 LTCCβ3亞基免疫組織化學(xué)染色。血管 von Kossa鈣化染色檢測血管鈣化情況，鈣鹽沉積處被染為黑色。血管鈣含量測定：鄰甲酚酞

5、絡(luò)合酮比色法測定鈣含量，以mg/g為單位。免疫組織化學(xué)法檢測血管runx2和LTCCβ3表達(dá)
　　3.各組VSMCs目的基因的表達(dá):提取細(xì)胞干預(yù)4天后正常+pH7.4組、高磷+pH7.1組、高磷+pH7.4組、維拉帕米干預(yù)組mRNA，測定L型鈣通道(cium channels, L-type, LTCC)β3亞基和runx2基因的表達(dá)。
　　4.各組VSMCs目的蛋白的表達(dá):Western印跡：L型鈣通道(calcium c

6、hannels, L-type, LTCC)β3亞基和runx2蛋白的表達(dá)。
　　5.VSMCs鈣化情況及ALP的活性測定。細(xì)胞鈣含量測定：細(xì)胞培養(yǎng)14天后棄去上清，BCA法測定細(xì)胞蛋白含量，結(jié)果用蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化鈣含量（mg/g蛋白）。茜素紅鈣化染色：茜素紅（0.1%，pH8.3）染液中37℃溫箱賦育30 min，結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：鈣鹽沉積為橘紅色。ALP活性測定：依據(jù)ALP活性試劑盒測定ALP活性，結(jié)果用蛋白質(zhì)校準(zhǔn)ALP活性。

7、>　　6.血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測定:在細(xì)胞刺激4天，采用鈣離子探針檢測VSMCs內(nèi)鈣離子濃度。
　　結(jié)果：
　　1.體外酸性環(huán)境對高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化的影響:細(xì)胞培養(yǎng)14天后，鈣含量結(jié)果與鈣化茜素紅染色一致，與正常+pH7.4組相比，高磷+pH7.4組鈣含量明顯增多，鈣鹽沉積較多；與高磷+pH7.4組相比，高磷+pH7.1組細(xì)胞鈣含量明顯減少，橘紅色鈣鹽沉積較少。
　　2.體外酸性環(huán)境對高磷誘導(dǎo)的VSMCs

8、LTCCβ3亞基的表達(dá)和細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流效應(yīng)的影響:RT-PCR和western印記結(jié)果顯示，高磷+pH7.4組LTCCβ3亞基mRNA表達(dá)和蛋白水平較正常+pH7.4組增加；但是高磷+pH7.1組的表達(dá)量明顯較高磷+pH7.4組表達(dá)減少。血管平滑肌細(xì)胞Fluo-3/AM熒光強(qiáng)度和熒光顯色結(jié)果顯示，與正常+pH7.4組相比，高磷+pH7.4組血管平滑肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加；與高磷+pH7.4組相比，高磷+pH7.1組胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度下降。

9、r>　　3.體外酸性環(huán)境對高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs runx2表達(dá)和ALP活性的影響:RT-PCR和western印記結(jié)果顯示保持一致，同正常+pH7.4組相比，高磷+pH7.4組runx2表達(dá)水平增加；與高磷+pH7.4組相比，高磷+pH7.1組表達(dá)量明顯減少。ALP活性測定結(jié)果顯示：酸性環(huán)境抑制了ALP活性。維拉帕米阻斷LTCC后，減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度，抑制高磷誘導(dǎo)的runx2表達(dá)，減少鈣鹽沉積。
　　4.酸性環(huán)境對慢性腎

10、衰竭大鼠主動(dòng)脈鈣化情況比較:與假手術(shù)組(n=6)大鼠相比，慢性腎衰竭組(n=5)、鈣化組(n=5)及酸干預(yù)組(n=6)大鼠血肌酐和尿素氮水平均顯著增高；與假手術(shù)組、慢性腎衰竭組(n=5)、鈣化組(n=5)分別比較，酸干預(yù)組大鼠動(dòng)脈血pH和[HCO3-]水平均下降。鈣含量結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比較，慢性腎衰竭組大鼠主動(dòng)脈鈣含量無明顯增高（2.33±0.42vs2.41±0.41，P＞0.05），鈣化組大鼠主動(dòng)脈鈣含量顯著增高（9.66±1

11、.62vs2.41±0.41，P＜0.05）；與鈣化組相比，酸干預(yù)大鼠主動(dòng)脈鈣含量明顯降低（4.83±0.73vs9.66±1.62，P＜0.05）。von Kossa染色結(jié)果保持一致。
　　5.體內(nèi)酸性環(huán)境對慢性腎衰竭大鼠LTCCβ3亞基和runx2在主動(dòng)脈的表達(dá)的影響:免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，假手術(shù)組和慢性腎衰竭組runx2和LTCCβ3亞基免疫組化評分均低于鈣化組（6.20±1.64vs2.16±0.75，6.20±1.64v

12、s3.00±1.00，6.60±2.51vs1.83±0.98，6.60±2.51vs2.60±0.55），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；大鼠體內(nèi)酸性環(huán)境下調(diào) runx2和 LTCCβ3亞基的表達(dá)(6.20±1.64vs3.83±1.33，6.60±2.51vs3.00±1.45, P<0.05)。
　　結(jié)論：酸性環(huán)境可以抑制VSMCs的鈣化，其機(jī)制可能是酸性環(huán)境通過下調(diào)L型鈣通道β3亞基表達(dá)，阻滯鈣離子內(nèi)流，來起到抗VSMCs成骨成軟骨樣表