基質(zhì)金屬蛋白酶12表達對糖尿病腎病及高脂腎損傷的腎保護作用及其機制的研究.pdf

1、隨著世界經(jīng)濟的飛速發(fā)展和人們生活水平的普遍升高，飲食結(jié)構(gòu)中高糖、高脂成分所占比率逐年提高，致使人類糖尿病及高脂血癥的發(fā)病率逐年增加。我國作為世界上最大的糖尿病流行地，超過1.3億的糖尿病患者給社會和家庭帶來沉重的負擔，糖尿病腎病（diabetic nephropathy, DN）作為糖尿病患者主要微血管并發(fā)癥之一，已經(jīng)成為終末期腎病（end stage renal disease, ESRD）的重要病因，與糖尿病患者的死亡率密切相關(guān)。同

2、時脂代謝紊亂如高脂血癥，也是糖尿病腎病的重要危險因素，增高的血脂可以直接沉積在腎臟中造成腎小球內(nèi)皮細胞、系膜細胞等損傷，加重腎小球硬化。因此糖尿病腎病以及高脂血癥伴隨血糖升高、血脂異?？梢鹨幌盗心I臟病理改變，包括細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）聚集、氧化應激、炎細胞浸潤等，加重腎臟纖維化（renal fibrosis）。腎臟纖維化又是所有慢性腎病（chronic kidney disease, CKD）

3、發(fā)展至終末期腎臟病的共同通路。目前認為腎臟纖維化是一個類似于損傷的愈合反應過程。在炎癥損傷反應過程中，腎臟內(nèi)出現(xiàn)單核細胞/巨噬細胞浸潤和 T細胞激活，活性氧（reactive oxygen species, ROS）產(chǎn)生增多，炎細胞及促炎細胞趨化因子分泌增加，上述病理改變又通過激活腎臟系膜細胞、成纖維細胞和腎小管上皮細胞分泌大量的ECM組分，逐漸加重腎臟纖維化，最終發(fā)展至終末期腎衰竭，而使正常腎功能永久喪失。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶-

4、12（matrix metalloproteinase-12, MMP-12），又稱為巨噬細胞金屬蛋白酶，最早是在巨噬細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種能夠降解彈性蛋白（elastin）的金屬蛋白酶。研究表明，MMP-12不僅可以降解其主要底物-彈性蛋白，而且同樣可以降解其它一些ECM組分，如IV型膠原、纖維連接蛋白（fibronectin, FN）、層粘連蛋白（laminin, LN）、Vitronectin、蛋白多糖、硫酸軟骨素和髓磷脂堿性蛋白等。目

5、前已知 MMP-12可在肥厚性破骨細胞、血管平滑肌細胞、活化的腎系膜細胞和一些癌癥細胞表達。MMP-12表達異常與腹主動脈瘤、動脈粥樣硬化和肺氣腫等疾病密切相關(guān)，但是 MMP-12的表達對于糖尿病腎病和高脂腎損傷中所產(chǎn)生的相關(guān)病理機制還鮮有報道。
　　目的：通過對體外培養(yǎng)的糖尿病大鼠腎小球系膜細胞以及DN、高脂腎損傷動物模型進行研究，觀察 MMP-12基因表達缺失在 DN和高脂腎損傷中細胞外基質(zhì)、氧化應激、炎細胞浸潤等方面發(fā)揮的腎

6、保護作用及其機制。
　　方法：
　　本研究利用體外培養(yǎng)的 SD大鼠腎小球系膜細胞（ glomerular mesangial cell, GMC），觀察高糖對GMC中MMP-12基因、大鼠GMC中ECM和氧化應激相關(guān)基因和蛋白表達的影響，并通過 siRNA敲低MMP-12基因的表達，觀察MMP-12基因表達降低后對與腎臟纖維化密切相關(guān)的TGF-β1信號途徑的影響。為闡明MMP-12的在DN中的相關(guān)機制，利用MMP-12基因敲

7、除小鼠構(gòu)建鏈脲佐菌素（streptozocin, STZ）誘導的糖尿病腎病動物模型，探討MMP-12基因表達缺失在DN中的腎保護作用。利用載脂蛋白E（apolipoprotein E, apo E）和MMP-12雙基因敲除小鼠構(gòu)建高脂飲食（high fat diet, HFD）誘導的小鼠高脂腎損傷動物模型，探討MMP-12基因表達缺失在高脂腎損傷中的腎保護作用。并同時應用熒光實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR（Real Time-qPCR）、West

8、ern blot檢測ECM、氧化應激和炎細胞浸潤相關(guān)基因 mRNA及蛋白質(zhì)表達變化；應用免疫熒光染色確定相關(guān)蛋白的相互作用；應用免疫組化染色觀察腎臟組織中ECM聚集、氧化應激、炎細胞浸潤這三方面病理改變，最終闡明 MMP-12基因表達缺失在糖尿病腎病小鼠模型和HFD誘導腎損傷小鼠動物模型中發(fā)揮的腎保護作用及其機制。
　　結(jié)果：
　　1 MMP-12對高糖誘導的大鼠GMC中ECM表達和氧化應激的影響
　　1.1 SD大鼠

9、腎小球系膜細胞分離和培養(yǎng)：SD大鼠GMC體外傳代培養(yǎng)后分為三組，即正常對照組（D-葡萄糖5.5mmol/L，NG組）、甘露醇組（甘露醇25mmol/L，MG組）、高糖組（D-葡萄糖30 mmol/L，HG組）。分別于處理后的不同時間點收集細胞，提取蛋白和總RNA，Western blot和Real Time-qPCR分析MMP-2、MMP-9、MMP-12、TGF-β、FN、LN等主要的ECM、氧化應激相關(guān)基因和蛋白表達的變化；通過si

10、RNA敲低MMP-12基因的表達觀察其對腎臟纖維化密切相關(guān)的TGF-β1信號途徑的影響。
　　1.2高糖誘導SD大鼠腎小球GMC上調(diào)ECM相關(guān)基因的表達：Real time qPCR的結(jié)果表明，與NG組相比，HG處理后GMC中的MMP-2、MMP-9、MMP-12、FN和 LN基因的表達均上調(diào)，其中 MMP-2、MMP-9、FN和LN基因的表達于6-12 h開始升高，呈時間依賴性，MMP-2到48 h時達到峰值，72 h后表達略有

11、下降，但仍高于NG組和MG組其他各時間觀察點（P<0.05）；MMP-9到24 h時達到峰值，48h、72 h后表達略有下降，但仍高于NG組和MG組其他各時間觀察點（P<0.05）；FN和LN到72 h時達到峰值；而MMP-12基因的表達于6 h開始升高，呈時間依賴性，到12 h時達到峰值（P<0.05），一直持續(xù)高表達至48h，72 h后表達略有下降，但仍高于NG組和MG組其他各時間觀察點（P<0.05）。
　　1.3高糖誘導G

12、MC上調(diào)氧化應激相關(guān)蛋白的表達：Western blot結(jié)果顯示，高糖能夠誘導GMC表達不同類型的NADPH氧化酶（Nox），與NG組相比，HG處理后Nox2、Nox4以及亞基p67phox和p22phox的表達在48 h后達到峰值，72 h后其表達仍然高于同一時間點 NG組和 MG組細胞（P<0.05）。
　　1.4敲低MMP-12基因的表達顯著抑制TGF-β1的信號途徑：Western blot結(jié)果顯示，GMC經(jīng) HG刺激后不

13、僅顯著上調(diào) TGF-?1的表達，而且促使TGF-β1（4 ng/mL，10 min）誘導的ERK1/2和Akt磷酸化增強。而siRNA敲低GMC中MMP-12基因的表達，則能夠顯著抑制HG上調(diào)的TGF-β1表達及其增強ERK1/2和Akt磷酸化的作用。
　　2 MMP-12基因表達缺失在糖尿病腎病小鼠模型中發(fā)揮腎保護作用
　　2.1 WT組小鼠和MMP-12-/-組小鼠生化指標和腎功能指標的變化：MMP-12基因敲除小鼠和相

14、同遺傳背景的 C57BL/6J（WT）小鼠腹腔一次性注射STZ（175 mg/kg）制備DN動物模型，造模成功后八周檢測小鼠生化指標和腎功能指標的變化。WT組小鼠和MMP-12-/-組小鼠無論是對照組（NC）還是糖尿病腎病組（DN）體重和血壓無顯著差異，但是 DN組的血糖水平顯著高于NC組（WT組，DN小鼠288.4±14.3 vs NC128.6±13.6, P<0.05；MMP-12-/-組，DN小鼠245.3±11.7 vs NC

15、134.9±14.1, P<0.05），該結(jié)果表明， MMP-12基因敲除能夠顯著抑制 STZ誘導血糖升高（MMP-12-/-組，DN245.3±11.7 vs WT DN288.4±14.3，P<0.05）。DN組同NC組相比，24小時尿白蛋白排泄（albumin excretion，μg/24 h）、血肌酐（SCR）和尿素氮（BUN）顯著升高（P<0.05），表明此時糖尿病腎臟病變加重，腎功能受損，但是MMP-12-/-組中DN小鼠

16、同WT組中DN小鼠相比，24小時尿白蛋白排泄、SCR和 BUN水平有顯著降低，表明MMP-12表達缺失能夠部分逆轉(zhuǎn)STZ誘導的腎損傷，對DN產(chǎn)生一定的腎保護作用。
　　2.2 MMP-12的表達與腎損傷程度密切相關(guān)：PAS染色結(jié)果表明，STZ誘導8周后，WT組中DN小鼠腎小球體積顯著增大、系膜基質(zhì)增多、基底膜增厚。MMP-12-/-組中DN小鼠同WT組DN小鼠相比，腎臟病變程度明顯減弱。同時免疫組化染色結(jié)果顯示，WT組中 DN小鼠

17、腎小球部位MMP-12陽性染色顆粒明顯增多，表明MMP-12的表達和腎小球病變程度具有正相關(guān)性。
　　2.3 MMP-12缺失抑制STZ誘導腎小球細胞外基質(zhì)聚集和促炎相關(guān)基因的表達：Real time qPCR結(jié)果顯示，MMP-12-/-組DN小鼠腎組織中MMP-12、MMP-2和 MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄水平較 WT組 DN小鼠表達顯著降低；MMP-12-/-組DN小鼠腎組織中TGF-β1及其下游FN和LN等纖維化相關(guān)基因表達均較W

18、T組的DN小鼠顯著下調(diào)；MMP-12基因缺失同時抑制了腎小球單核細胞/巨噬細胞標記分子單核細胞趨化因子-1（ monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）和CD11b的表達。
　　2.4 MMP-12缺失逆轉(zhuǎn)在腎小球STZ誘導的巨噬細胞浸潤：免疫組化結(jié)果表明，與WT組NC小鼠相比，WT組DN小鼠腎小球區(qū)域能檢測到較強的CD68陽性染色顆粒，而在MMP-12-/-組DN小鼠腎小球中CD68的表達卻顯著低

19、于WT組DN小鼠，Real time qPCR結(jié)果也同時證實了CD68轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平具有相同的變化趨勢。
　　2.5 MMP-12缺失抑制STZ誘導的腎小球氧化應激：Western blot結(jié)果表明WT組中，STZ誘導DN小鼠腎小球中Nox4和p67phox表達顯著增加，而MMP-12表達缺失能夠顯著降低腎小球中Nox4和p67phox的表達。STZ的誘導作用通常是通過激活上游的 MCP-1和 TGF-β的表達來完成的。同WT

20、組對照小鼠相比，STZ誘導WT組DN小鼠腎小球中MCP-1和TGF-β的表達及其下游信號分子ERK1/2和Akt的磷酸化顯著增加，而MMP-12表達缺失能夠逆轉(zhuǎn) STZ對這兩種促氧化應激蛋白的表達和下游信號分子的磷酸化的促進作用。
　　3 MMP-12基因表達缺失在高脂腎損傷小鼠模型中發(fā)揮腎保護作用
　　3.1 MMP-12缺失逆轉(zhuǎn) HFD誘導的腎損傷：HFD飼養(yǎng) apo E?/?和 apo E?/?MMP-12?/?小鼠不

21、同時間點后生化指標顯示， apo E?/?和 apo E?/?MMP-12?/?小鼠的體重、血壓、總膽固醇、甘油三酯、HDL和 LDL水平在各組無明顯差異。同正常飲食小鼠相比，反映腎功能指標的24小時尿蛋白定量和血清肌酐濃度在HFD后第6和第9個月顯著增高，但是apo E?/?MMP-12?/?小鼠 HFD組這兩個指標顯著低于同時間點 HFD組的 apo E?/?相小鼠，該結(jié)果表明 MMP-12缺失能夠部分逆轉(zhuǎn) HFD誘導的腎臟損傷。<

22、br>　　3.2 HFD誘導腎小球MMP-12的表達：免疫組化和Real-time qPCR結(jié)果顯示，在HFD誘導的apo E?/?小鼠中，MMP-12陽性染色顆粒隨HFD處理時間的延長呈持續(xù)增多的趨勢；腎小球MMP-12 mRNA水平通過qRT-PCR進行分析，結(jié)果顯示了相同的變化趨勢。
　　3.3 MMP-12缺失抑制HFD誘導的腎小球胞外基質(zhì)聚集和促炎相關(guān)基因的表達：免疫組化和Real-time qPCR技術(shù)顯示，HFD能夠

23、誘導apo E?/?小鼠FN和IV型膠原在腎組織的持續(xù)表達，而MMP-12缺失則可逆轉(zhuǎn)HFD誘導的FN和IV型膠原的表達上調(diào)過程；Real-time qPCR結(jié)果表明，HFD處理3個月后 apo E?/?小鼠腎臟纖維化標記基因 TGF-β1，炎癥相關(guān)基因MCP-1和CD11b的mRNA水平顯著增加，而apo E?/?MMP-12?/?小鼠腎小球中這兩類基因的mRNA水平顯著低于同時間點的apo E?/?小鼠；
　　3.4 MMP-

24、12缺失逆轉(zhuǎn)HFD誘導的巨噬細胞在腎小球的募集和浸潤：免疫組化和Real-time qPCR結(jié)果顯示， apo E?/?小鼠腎小球巨噬細胞募集和浸潤在HFD處理后3、6、9個月持續(xù)表達增強，而MMP-12缺失可以抑制HFD誘導的巨噬細胞在腎小球的募集和浸潤。3D膠細胞體外侵染實驗進一步表明，MMP-12缺失能夠拮抗或抑制HFD誘導的巨噬細胞募集和浸潤過程。免疫熒光染色后應用激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示腎小球MMP-12是由募集和浸潤的

25、巨噬細胞分泌或是由損傷導致的活化系膜細胞分泌。
　　3.5 MMP-12缺失抑制HFD誘導的腎小球氧化應激過程：Western blot結(jié)果顯示HFD能夠誘導apo E?/?小鼠Nox4和p67phox的持續(xù)表達，而MMP-12缺失則逆轉(zhuǎn)HFD誘導的Nox4和p67phox的表達上調(diào)過程。對其信號途徑的研究表明，HFD誘導的apo E?/?小鼠腎小球中ERK1/2和Akt的磷酸化水平在3-6個月時顯著增強，但這種影響可在MMP-1

26、2表達缺失時而被顯著抑制。
　　結(jié)論：
　　1高糖可以誘導腎小球系膜細胞中MMP-12、細胞外基質(zhì)組分、促炎因子及氧化應激等相關(guān)基因的表達上調(diào)；
　　2敲低 MMP-12基因的表達顯著抑制與腎臟纖維化密切相關(guān)的TGF-?1的信號途徑；
　　3 MMP-12基因表達缺失可以通過降低FN、LN、IV型膠原減少細胞外基質(zhì)聚集，通過減少NADPH氧化酶表達抑制氧化應激，通過降低促炎因子表達抑制炎細胞浸潤，進而在 STZ誘