糖尿病足患者外周血基質(zhì)金屬蛋白酶-2和-9表達(dá)的研究.pdf

1、目的：糖尿病足(Diabetic foot，DF)難愈潰瘍的基本病理改變，主要表現(xiàn)為潰瘍處基質(zhì)不能沉積，膠原蛋白過度分解，不能填充創(chuàng)面，角質(zhì)細(xì)胞不能移行到創(chuàng)面，并伴有局部缺血缺氧，炎性細(xì)胞侵潤，及微生物感染等，使?jié)兿蛏詈蛷V擴(kuò)大。而降解細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的主要依靠基質(zhì)金屬蛋白酶家族(Metalloproteinases，MMPs)的調(diào)控。已有的報(bào)道發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面MMPs及其組織抑制因子(Tissue

2、 inhibitor ofmetalloproteinase，TIMP)失去正常的動態(tài)平衡，MMPs增加，TIMP下降，并發(fā)現(xiàn)糖尿病大血管病變患者血清中也存在MMPs/TIMP比例異常。糖尿病足潰瘍創(chuàng)面取材困難，制約深入研究。本課題對糖尿病足患者外周血標(biāo)本進(jìn)行研究，探討MMPs家族中MMP-2和MMP-9在蛋白、基因水平的變化及其機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療糖尿病足病提供新的研究方向。
　　 方法：
　　 1.隨機(jī)抽取2007

3、年3月～2009年9月符合入選標(biāo)準(zhǔn)的糖尿病足患者(DF組)78例，男44例，女34例，年齡48～81歲，平均64.3歲；糖尿病病程3～28年，平均14.6年；創(chuàng)面范圍0.5cm×1cm～13×4cm;足部潰瘍病程2周～5個月，平均1.9個月；111例為非糖尿病足糖尿病對照組(Diabetes without foot ulcers，NDF)，男60例，女51例，年齡52～79歲，平均66.2歲；糖尿病病程5～18年，平均13.1年；健康

4、對照組(CON)，為我院退休職工健康體檢者150例，排除糖尿病、糖調(diào)節(jié)異常，無大血管病變。男79例，女71例，年齡56～82歲，平均65.5歲。NDF、CON組均無足部潰瘍或其他部位慢性潰瘍史，近3個月內(nèi)無急性外傷史，并除外心功能不全及嚴(yán)重肝功、腎功不全者。
　　 (1)測定三組TG、CHO、LDL-C、HDL-C、FINS、FPG、HbAIc，計(jì)算HOMA-IR，檢測靜脈全血白細(xì)胞計(jì)數(shù)。ELISA測定測定血清AGEs、MMP-

5、2、MMP-9、TIMP-1濃度。
　　 (2)明膠酶譜法測定各組血清中MMP-2和MMP-9的活性酶表達(dá)量。
　　 (3)RT-PCR法分析三組外周靜脈血白細(xì)胞MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)情況。
　　 (4)兩因素兩水平的析因分析方法：對所有78例糖尿病足慢性潰瘍患者按照TEXAs分類方法進(jìn)行分期和分類。針對病因分為兩類，即感染和缺血。感染性因素(A)有兩個水平，有(a1)和無(a2)；缺血因素(B)也

6、是兩個水平，有(b1)和無(b2)。判斷不同病因?qū)MPs表達(dá)的影響，哪種病因?yàn)橹餍?yīng)，兩種病因有無交互作用。具體步驟：①將2×2析因處理看做4個單因素，即甲(TEXAs分類法的D期)=a1b1，乙（B期）=a1b2，丙（C期）=a2b1，丁(A期)=a2b2。②采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，將符合每一個單因素的DF患者按照完全隨機(jī)法進(jìn)入析因分析。③每個單因素組中DF患者4例，共16例。
　　 2.1999年3月—2009年9月我院內(nèi)分泌科

7、門診及住院的新診斷的DF患者242例，所有DF均為首次發(fā)生足部潰瘍。采用前瞻性研究方法，對242例入選的DF分別采用Wagner分級法和TEXAS大學(xué)分類法分類，參照美國ADA糖尿病足協(xié)助組對DF檢查和危險(xiǎn)因素的評估方法診斷下肢動脈缺血和周圍神經(jīng)病變，判斷潰瘍性質(zhì)為神經(jīng)性、神經(jīng)缺血性、缺血性及非神經(jīng)非缺血性潰瘍。病情穩(wěn)定出院及門診治療的患者每周隨訪一次，觀察隨訪期為6個月，在此期間內(nèi)潰瘍?nèi)?、截肢及死亡為終點(diǎn)事件。
　　 結(jié)果：

8、
　　 1.DF、NDF和CON組一般情況的比較
　　 DF、NDF和CON組的年齡、性別及民族等因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，吸煙史在3組之間比較未達(dá)統(tǒng)計(jì)意義，具有可比性；DF組并發(fā)大血管病變者為59例（患病率為75.6％），NDF組并發(fā)大血管病變者為80例(72.1％)；DF組并發(fā)微血管病變者為45例(57.7％)，NDF組并發(fā)微血管病變者為68例(61.3％)；DF和NDF兩組血管并發(fā)癥（大血管及微血管并發(fā)癥）發(fā)生率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差

9、異(x2大血管=0.5466，P=0.4597;x2微血管=0.247，P=0.6223)，具有可比性；DF和NDF兩組血壓均高于CON組，DF與NDF之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.生化指標(biāo)的比較
　　 與對照組相比，糖尿病兩組FPG、HbA1C、TG、CHO、AGEs、WBC計(jì)數(shù)、HOMA-IR、MMP-2、MMP-9均明顯升高（P＜0.05）。NDF組和DF組FPG、HbA1C、AGEs和TG比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

10、（P＞0.05）。全血WBC計(jì)數(shù)，三組逐漸升高：（4.35±0.47）×109/L，（6.17±0.84）×109/L，（7.62±1.13）×109/L，兩兩比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；NDF組AGEs93±10.5mg/L，DF組106.5±22.9mg/L，均高于CON35.1±7.3mg/L;NDF組TIMP-1均值334.5μg/L雖低于CON組378.8μg/L，但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MMP-2/T

11、IMP-1比值在兩組間也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；DF組MMP-2水平81.7(48.8)μg/L、MMP-2/TIMP-1比值0.3(0.1)，高于NDF組[46.1(18.2)μg/L，0.1(0.1)]；DF組TIMP-1水平252.5(131.6)μg/L，低于NDF組378.8(190.0)μg/L;DF組MMP-9水平624.4(485.3，994.6)μg/L高于NDF組136.1(107.4，275.1)μg/L，均

12、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　 3.MMP-2與其他各指標(biāo)的Spearman秩相關(guān)分析及回歸分析Spearman秩相關(guān)顯示，MMP-2血清水平與HbA1C（r=0.387）、TG(r=0.169)、AGEs(r=0.221)、病程(r=0.214)、SBP(r=0.135)呈正相關(guān)(P＜0.05)，與TIMP-1血清水平呈高度負(fù)相關(guān)（r=-0.852，P＜0.05）；與WBC計(jì)數(shù)的相關(guān)系數(shù)r=0.014，P＞0.05，無

13、統(tǒng)計(jì)意義。經(jīng)多元線性逐步回歸分析，最優(yōu)回歸方程為：LnMMP-2=6.264-0.591×LnTIMP-1+0.392×Ln（病程）+0.281×HbAlC+0.152×年齡。
　　 4.DF危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析以有無DF為應(yīng)變量y，病程、血管并發(fā)癥、吸煙史、MMP-2/TIMP-1比值、MMP-2、FPG、HbA1C、AGEs、WBC計(jì)數(shù)、血脂、血壓、和胰島素抵抗指數(shù)等作為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析。MM

14、P-2、大血管并發(fā)癥、糖尿病微血管并發(fā)癥和TG進(jìn)入回歸方程，是DF的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　 5.MMP-9與其他各指標(biāo)的Spearman秩相關(guān)分析及回歸分析 MMP-9與AGEs的相關(guān)性不強(qiáng)，r=0.281，P＜0.05;MMP-9血清水平與WBC計(jì)數(shù)呈較強(qiáng)正相關(guān)，r=0.776，P＜0.05。LnMMP-9為應(yīng)變量的回歸分析，最優(yōu)回歸方程為：LnMMP-9=3.475+0.612×AGEs+0.435×WBC+0.281×Ln(

15、病程)+0.041×年齡。
　　 6.以高M(jìn)MP-9水平為暴露因素，計(jì)算高M(jìn)MP-9的糖尿病患者發(fā)生DF的相對危險(xiǎn)度(OR值)。血清MMP-9資料屬偏態(tài)分布，用百分位數(shù)法計(jì)算對照組MMP-9的上側(cè)界值(95百分位數(shù))為169.6μg/L，即血清MMP-9水平＞169.6μg/L，定義為高M(jìn)MP-9血癥。采用病例對照研究資料的四格表形式計(jì)算OR值。OR=20.682，OR值的可信區(qū)間為(8.955，47.767)。(x2=66.5

16、34)說明糖尿病患者血清MMP-9升高患糖尿病足潰瘍的風(fēng)險(xiǎn)是非升高者的20倍。
　　 7.明膠酶譜測定結(jié)果顯示，MMP-2和MMP-9的活性在CON、NDF和DF組表現(xiàn)不同，MMP-2酶的比活性分別為0.4±0.0、7.0±3.3、8.2±4.5(A·mm2·g-1·L-1)，糖尿病組兩兩比較未發(fā)現(xiàn)差別(P＞0.05)。活性MMP-9酶的比活性逐步升高，三組分別為1.5±0.3、17.0±6.8和40.1±8.3(A·mm2·g

17、-1·L-1)，兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 8.前瞻性研究中242例DF中痊愈者147例(60.7％)，截肢者48例(19.8％)，未愈者34例(14.0％)，死亡13例(5.4％)。全部愈合病例的愈合時間中位數(shù)M=8.4周，QR=14周。3例缺血性潰瘍在觀察期內(nèi)采用自體骨髓干細(xì)胞移植術(shù)（2例），血管成形術(shù)（1例），在隨訪結(jié)束前愈合，術(shù)后愈合時間分別為7.6、10、4.8周。
　　 9.Wagner分級

18、方法：隨著分級升高，截肢率升高，分級與截肢率存在正趨勢(x2趨勢=79.6420，P＜0.001)；TEXAS大學(xué)分類法：隨分期升高，截肢率升高，分期與截肢率存在正趨勢(x2趨勢=32.8046，P＜0.001)，分級與截肢率也存在正趨勢(x2趨勢=39.2448，P＜0.001)
　　 10.比較不同病因(TEXAS大學(xué)分類法的分期)發(fā)生截肢的風(fēng)險(xiǎn)
　　 記錄242例DF患者6個月內(nèi)截肢發(fā)生的情況，截肢率A期1.4％、

19、B期29.8％、C期10.8％、D期41.2％。比較缺血性潰瘍（C+D期，截肢率為28.4％）與非缺血性潰瘍（A+B期，截肢率16.9％）其風(fēng)險(xiǎn)增加近2倍[RR=1.954，95％CI(1.044，3.655)]；而合并感染和缺血的潰瘍(D期)較無缺血、感染的潰瘍(A期)發(fā)生下肢截肢的風(fēng)險(xiǎn)增加48倍[RR=48.300，95％CI(6.209,375.703)]。
　　 11.比較潰瘍愈合時間與分級和分期的關(guān)系，經(jīng)過log-ra

20、nk檢驗(yàn)僅TEXAS大學(xué)分類法的分期對潰瘍愈合時間有影響（log-rank檢驗(yàn)x2=11.234，df=3，P=0.012）。Wagner和TEXAS大學(xué)分類法的不同分級潰瘍愈合時間經(jīng)檢驗(yàn)未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＞0.05)
　　 12.CON、NDF和DF組MMP-2、MMP-9mRNA的表達(dá)區(qū)別
　　 CON組WBC的MMP-2、MMP-9mRNA表達(dá)為0；NDF組MMP-2mRNA表達(dá)微弱為相對水平為0.07±0.

21、01，MMP-9mRNA表達(dá)略強(qiáng)為0.53±0.05;DF組MMP-2mRNA表達(dá)較NDF組為高，但仍較弱0.27±0.09，兩兩比較達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，MMP-9mRNA表達(dá)較為顯著7.42±3.39，較NDF組(0.53±0.05)顯著升高(F=81.485，P＜0.0001)。
　　 13.析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果
　　 感染和缺血因素對DF患者的MMP-9mRNA表達(dá)均具有影響，效應(yīng)達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

22、感染可使糖尿病足患者外周血WBC的MMP-9mRNA表達(dá)水平平均增加7.17，缺血可增加糖尿病足患者外周血WBC的MMP-9mRNA表達(dá)水平平均增加2.73，兩者存在正協(xié)同作用。結(jié)合4個分期的MMP-9mRNA表達(dá)的均數(shù)情況，可以認(rèn)為感染因素對于DF患者WBC MMP-9的mRNA表達(dá)起主要作用，缺血也有較重要的作用，兩者有協(xié)同促進(jìn)WBC的MMP-9表達(dá)作用。
　　 總的方差：F=96.57，P＜0.0001;感染因素：F=23

23、.41，P＜0.0001;缺血因素：F=34.63，P＜0.0001;交互作用：F=17.66，P=0.0012。
　　 14.應(yīng)用SNK-q法比較TEXAs大學(xué)分類法2級、3級、4級潰瘍患者WBCMMP-9mRNA表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)此三組MMP-9mRNA表達(dá)無明顯差異（兩兩比較P值均＞0.05）
　　 結(jié)論：
　　 1.糖尿病患者未發(fā)生足部潰瘍前，血清MMP-2即開始升高，糖尿病足潰瘍患者血清MMP-2明顯升高，

24、伴有TIMP-1水平下降，MMP-2/TIMP-1升高；MMP-2與TIMP-1高度負(fù)相關(guān)，與糖尿病病程和HbA1C正相關(guān)；MMP-2升高是糖尿病足的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　 2.糖尿病患者發(fā)生DF前血清MMP-9濃度較同齡健康對照組升高1.5倍，DF血清MMP-9升高達(dá)7倍；MMP-9血清水平與WBC計(jì)數(shù)呈較強(qiáng)正相關(guān)；糖尿病患者血清MMP-9升高患糖尿病足潰瘍的風(fēng)險(xiǎn)是非升高者的20倍。
　　 3.明膠酶譜發(fā)現(xiàn)MP-2和MM

25、P-9的活性不同：糖尿病足患者血清MMP-2活性弱，而MMP-9活性相對較強(qiáng)。
　　 4.TEXAS大學(xué)分類法較Wagner分級法更為全面的評估糖尿病足預(yù)后，有更強(qiáng)的預(yù)測價(jià)值，容易分級和分期，值得在臨床推廣應(yīng)用。
　　 5.糖尿病足外周血白細(xì)胞在mRNA水平強(qiáng)表達(dá)MMP-9，但是MMP-2表達(dá)較弱。感染和缺血因素對DF患者的MMP-9mRNA表達(dá)均具有影響，感染因素對于DF患者WBC MMP-9的mRNA表達(dá)起主要作用，