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1、目的:卵巢的卵泡發(fā)育是一個(gè)較為復(fù)雜的過程。它主要包括卵母細(xì)胞生長(zhǎng)、顆粒細(xì)胞增殖、分化、閉鎖、凋亡等重要事件。在這一過程中,多種蛋白水解酶參與了這些重要事件的調(diào)控。lmp2是蛋白水解酶復(fù)合體中的一個(gè)重要的功能性亞單位,它對(duì)蛋白水解酶復(fù)合體發(fā)揮水解酶活性至關(guān)重要。lmp2生殖系統(tǒng)中的研究較少;特別是在卵巢的發(fā)育中的作用尚未有報(bào)道。因此,本研究探索了在卵泡發(fā)育過程中,lmp2基因的表達(dá)規(guī)律及其可能的作用。 研究方法:本文應(yīng)用HE染色、
2、免疫組化、細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)TUNEL、原代顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)及westernblot的方法檢測(cè)了lmp2在大鼠不同發(fā)育時(shí)期卵泡及人工體外誘導(dǎo)卵泡閉鎖凋亡的卵泡中的表達(dá)情況。將未成年大鼠(21日齡)注射孕馬血清(PMSG),注射12、24、36和48小時(shí)后分別收集卵巢,注射PMSG24小時(shí)的基礎(chǔ)上再注射anti—PMSG抗體24小時(shí)后收集卵巢,進(jìn)行石蠟切片;分別選取相鄰的連續(xù)切片,蘇木素—伊紅(HE)染色觀察PMSG誘導(dǎo)后大鼠卵泡不同發(fā)育階
3、段的形態(tài)及體外誘導(dǎo)閉鎖的卵泡形態(tài);免疫組化方法檢測(cè)lmp2的表達(dá)情況;細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)TUNEL檢測(cè)lmp2的表達(dá)模式與卵泡閉鎖及卵泡顆粒細(xì)胞程序性死亡的相互關(guān)系。另外,體外相同條件誘導(dǎo)大鼠卵泡發(fā)育到不同時(shí)期及閉鎖后,用針頭刺破卵泡,400目細(xì)胞篩網(wǎng)分離顆粒細(xì)胞,用NP40裂解液裂解卵泡顆粒細(xì)胞收集全細(xì)胞總蛋白;westernblot方法檢測(cè)lmp2在發(fā)育不同階段及閉鎖卵泡中的表達(dá)。 結(jié)果顯示:在大鼠卵巢發(fā)育的初級(jí)卵泡階段,lm
4、p2的表達(dá)較高,在大腔卵泡時(shí)期lmp2表達(dá)較低;與之對(duì)應(yīng)的TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果,表明lmp2表達(dá)高的卵泡有凋亡信號(hào);在體外誘導(dǎo)卵泡發(fā)生閉鎖凋亡的卵泡中,TUNEL染色與lmp2的表達(dá)位置有較強(qiáng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系;在westernblot的結(jié)果中,在卵泡發(fā)育前期即初級(jí)卵泡階段,lmp2的表達(dá)較高,而在大腔卵泡時(shí)期,lmp2的表達(dá)處在相對(duì)較低的水平。 結(jié)論:westernblot結(jié)果與免疫組化結(jié)果表明lmp2在不同發(fā)育時(shí)期卵泡中有相似表達(dá)規(guī)律
5、。討論:本論文首次在卵巢中探索lmp2是否發(fā)揮作用及怎樣發(fā)揮作用,并作了較為深入的研究。經(jīng)過理論探討和實(shí)驗(yàn)探索驗(yàn)證,結(jié)果證明,在卵巢的卵泡發(fā)育過程中,lmp2有明顯的表達(dá)且有差異。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,lmp2可能參與卵泡發(fā)育、閉鎖和顆粒細(xì)胞凋亡等重要過程。lmp2在卵泡發(fā)育過程中可能通過引起顆粒細(xì)胞的凋亡,誘導(dǎo)卵泡發(fā)生閉鎖凋亡。以上結(jié)果暗示,lmp2可能成為治療卵巢相關(guān)疾病的新的靶點(diǎn),并且為在以后的研究卵巢相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理的過程中,
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