褪黑素對豬卵泡發(fā)育與閉鎖的影響研究.pdf

1、卵泡是哺乳動物卵巢的基本結(jié)構(gòu)與功能單元，哺乳動物卵巢內(nèi)存在大量處于不同發(fā)育階段的卵泡，但是大部分卵泡在發(fā)育的不同階段會發(fā)生退化和閉鎖，只有少數(shù)才能發(fā)育成熟以致排卵。卵泡的發(fā)育與閉鎖是一個受內(nèi)分泌、旁分泌及基因調(diào)節(jié)的復(fù)雜生理過程，研究豬卵泡的發(fā)育與閉鎖對更好地理解母豬的生殖機理及進一步提高母豬繁殖力均具有重要的理論價值和現(xiàn)實意義。褪黑素主要是由哺乳動物松果體產(chǎn)生的一種吲哚胺類激素，是聯(lián)系機體神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的重要因子之一。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑

2、素具有較強的氧自由基清除功能，對人類、豬、牛、綿羊、大鼠、小鼠等物種的生殖機能具有調(diào)控作用。然而，有關(guān)褪黑素對豬卵泡閉鎖的影響研究目前尚無系統(tǒng)報道。本研究探討褪黑素受體基因在母豬不同組織中的表達規(guī)律，揭示豬不同程度閉鎖有腔卵泡中褪黑素的含量水平，解析內(nèi)源性褪黑素水平與卵泡閉鎖的相關(guān)性，并進一步以豬健康有腔卵泡和顆粒細胞為體外培養(yǎng)模型，探討不同水平褪黑素處理對體外培養(yǎng)豬有腔卵泡發(fā)育潛能的影響，以及褪黑素影響顆粒細胞凋亡與類固醇生成的作用途

3、徑，為進一步認識褪黑素對豬卵泡發(fā)育與閉鎖的影響及其分子調(diào)控機制提供新的依據(jù)。本研究獲得如下結(jié)果:
　　1.成年母豬的腦、肝臟、胰臟、脂肪、卵巢、腎臟、心臟和脾臟等組織中均存在褪黑素受體基因MT1和MT2表達，豬卵巢和腦組織中MT1和MT2的mRNA表達均顯著高于其它組織(P＜0.05)。
　　2.褪黑素在豬有腔卵泡中的含量分布呈顯著差異(P＜0.05)，健康卵泡中褪黑素水平最高，早期閉鎖卵泡中次之，晚期閉鎖卵泡中最低。不同程

4、度閉鎖卵泡中顆粒細胞的凋亡率順序為:晚期閉鎖卵泡＞早期閉鎖卵泡＞健康卵泡。卵泡內(nèi)褪黑素水平與顆粒細胞凋亡率的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.847，褪黑素水平與卵泡閉鎖存在強的負相關(guān)性。健康卵泡顆粒細胞中褪黑素受體MT1和MT2表達顯著高于閉鎖卵泡(P＜0.05)，褪黑素及其受體可能在豬卵泡發(fā)育與閉鎖調(diào)控中發(fā)揮重要作用。
　　3.體外培養(yǎng)直徑3～5 mm的豬健康有腔卵泡，添加不同濃度褪黑素(0，0.05，0.2，0.8 ng/mL)處理6d

5、，檢測褪黑素對體外培養(yǎng)豬有腔卵泡發(fā)育潛能的影響。結(jié)果揭示，培養(yǎng)48 h后，0.05，0.2和0.8 ng/mL褪黑素處理均提高了卵丘顆粒細胞層數(shù)，其中添加0.8 ng/mL褪黑素組A級COCs比率(17/48)最高。培養(yǎng)6d后，褪黑素各處理均顯著提高了卵泡的存活率及卵泡膜完整率，添加0.2 ng/mL褪黑素組卵泡存活率達95.83％，膜完整性達72.22％。培養(yǎng)3d后，0.05 ng/mL褪黑素處理有腔卵泡獲取的卵母細胞卵丘擴散率達到8

6、8.89％，0.2 ng/mL褪黑素處理卵母細胞極體排出率達56.94％，顯著高于對照組(P＜0.05)。培養(yǎng)3d后，褪黑素各處理均顯著降低了體外培養(yǎng)有腔卵泡中顆粒細胞的凋亡率(P＜0.05)。表明添加0.05，0.2及0.8 ng/mL褪黑素對體外培養(yǎng)有腔卵泡的存活、卵丘增殖、卵泡膜完整性維持等均具有促進作用，并且能夠顯著抑制顆粒細胞凋亡。
　　4.分離3～5 mm健康卵泡的顆粒細胞，添加不同水平褪黑素(0，0.001，0.01

7、，0.1，1.0，10 ng/mL)體外培養(yǎng)48 h后，檢測褪黑素處理對體外培養(yǎng)顆粒細胞增殖凋亡及類固醇生成的影響。結(jié)果表明，添加0.01 ng/mL褪黑素能夠顯著促進體外培養(yǎng)顆粒細胞的增殖活力及集落形成(P＜0.01)，刺激體外培養(yǎng)顆粒細胞的E2分泌(P＜0.05)，下調(diào)P4水平(P＜0.05)，上調(diào)類固醇合成酶CYP17A和CYP19A的表達(P＜0.05)，抑制顆粒細胞凋亡(P＜0.05)。采用0.01 ng/mL褪黑素(MT)或

8、MT聯(lián)用其受體激動劑與拮抗劑（（MT+IIK-7，MT+Luzindole，MT+4P-PDOT）處理體外培養(yǎng)顆粒細胞，檢測發(fā)現(xiàn)，MT及MT+IIK-7處理均能顯著抑制顆粒細胞凋亡(P＜0.05)，并上調(diào)MT2、Bcl-2、SOD1及GPX4的表達(P＜0.05)，降低Bax、P53和Caspase-3的表達(P＜0.05);與MT處理相比，MT+Luzindole及MT+4P-PDOT處理組顆粒細胞的凋亡率則明顯上升(P＜0.05)，

9、MT單獨處理引起的相關(guān)基因表達變化也被阻斷或消減(P＜0.05)。表明褪黑素可通過MT2受體激活方式上調(diào)體外培養(yǎng)顆粒細胞中Bcl-2、GPX4和SOD1表達，下調(diào)Caspase-3、P53和Bax表達，從而抑制顆粒細胞凋亡。
　　5.體外無血清或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導條件培養(yǎng)豬卵巢顆粒細胞，添加不同水平褪黑素(0，0.001，0.01，0.1，1.0，10 ng/mL)處理24 h，檢測褪黑素處理對顆粒細胞增殖與凋亡的作用。結(jié)果證明，1.

10、0 ng/mL褪黑素處理顯著抑制了由血清剝奪誘發(fā)的顆粒細胞凋亡(P＜0.05)，而Luzindole具有抵消褪黑素抗凋亡效應(yīng)的作用(P＜0.05)。與衣霉素Tun陽性處理、血清剝奪處理及空白對照相比，1.0 ng/mL褪黑素處理及血清剝奪后添加1.0 ng/mL褪黑素處理均顯著抑制了顆粒細胞凋亡(P＜0.05)。各處理對體外培養(yǎng)顆粒細胞中MT1和FAS表達無明顯影響(P＞0.05)。與空白對照組及MT+Luzindole組相比較，1.0

11、 ng/mL褪黑素處理顯著上調(diào)了MT2表達(P＜0.05),抑制了FASL、CHOP和GRP78的表達(P＜0.05);與對照組相比較，含1.0 ng/mL褪黑素各組SOD1和GPX4表達水平均顯著升高(P＜0.05)。褪黑素可通過其受體激活途徑調(diào)控FAS、FSA L、 CHOP、GRP78、SOD1和GPX4基因的表達，從而有效抑制體外培養(yǎng)顆粒細胞的凋亡。
　　綜上所述，豬卵泡中褪黑素水平與卵泡閉鎖程度緊密相關(guān)，添加適宜水平褪黑