阿魏酸對HUVECs冷刺激模型TRPM8-HIF-1α-ET-1信號通路影響研究.pdf

1、目的：本課題是國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目―當(dāng)歸四逆湯解痙通脈機(jī)制研究的一部分。當(dāng)歸是當(dāng)歸四逆湯的主藥，阿魏酸是當(dāng)歸的主要活性成分。本課題通過建立不同溫度HUVECs急性冷刺激模型，觀察阿魏酸是否通過TRPM8/HIF-1α/ET-1信號通路介導(dǎo)ET-1合成和分泌，調(diào)控ET-NO平衡，參與內(nèi)皮依賴性血管收縮舒張功能調(diào)節(jié)。
　　方法：HUVECs培養(yǎng)至95％融合后，分別用18℃、4℃刺激5小時(shí)，空白對照組培養(yǎng)溫度保持37℃，阿魏酸干預(yù)使用5

2、0μM、100μM、200μM三個(gè)劑量組，并分別設(shè)置TRPM8拮抗劑AMTB組（20μM）及TRPM8激動(dòng)劑WS-12（20μM）。采用MTT法檢測HUVECs細(xì)胞活性，收集培養(yǎng)基上清和細(xì)胞，生化檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量和LDH活性。ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中ET-1含量，Q-PCR法檢測HUVECs TRPM8、iNOS、eNOS、ET-1 mRNA表達(dá)，Western Blot法檢測HUVECs TRPM8、HIF-1α、iNOS

3、、eNOS、ET-1蛋白表達(dá)。正態(tài)分布的計(jì)量資料以x?s表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析，組間比較采用 SNK法或Tamhane`s T2法。
　　結(jié)果：與空白對照組相比，18℃模型組HUVECs形態(tài)無明顯改變，4℃模型組細(xì)胞皺縮，邊緣不規(guī)則，細(xì)胞間距增大；18℃模型組培養(yǎng)基中 LDH活性和 ET-1含量、TRPM8、iNOS、ET-1和HIF-1α表達(dá)水平顯著增強(qiáng)（P＜0.05），培養(yǎng)基中NO含量、eNOS表達(dá)水平顯著降低（

4、P＜0.05）；4℃模型組培養(yǎng)基中 NO含量、LDH活性和HUVECs細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），培養(yǎng)基中ET-1含量、TRPM8、iNOS、ET-1、eNOS和HIF-1α表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與18℃模型組相比，中、高劑量阿魏酸組培養(yǎng)基中LDH活性和ET-1含量、TRPM8、iNOS、ET-1和HIF-1α表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），拮抗劑組培養(yǎng)基中ET-1含量和激動(dòng)劑組培養(yǎng)基中LDH活性和iNOS表達(dá)水平顯

5、著降低（P＜0.05），培養(yǎng)基中NO含量、eNOS表達(dá)水平顯著增強(qiáng)（P＜0.05），激動(dòng)劑組培養(yǎng)基中 ET-1含量、ET-1和 HIF-1α表達(dá)水平顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。和18℃激動(dòng)劑組相比，激動(dòng)劑+阿魏酸組培養(yǎng)基中ET-1含量、ET-1、iNOS和HIF-1α表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與4℃模型組相比，中、高劑量阿魏酸組細(xì)胞活力、TRPM8、eNOS和 HIF-1α表達(dá)水平顯著增強(qiáng)（P＜0.05），拮抗劑組培養(yǎng)基中 LDH

6、活性和激動(dòng)劑組細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），拮抗劑組細(xì)胞活力和激動(dòng)劑培養(yǎng)基中 LDH活性顯著降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1、不同溫度低溫暴露對TRPM8表達(dá)呈相反影響，18℃上調(diào)TRPM8表達(dá)，4℃下調(diào)TRPM8表達(dá)；2、18℃冷暴露可能通過TRPM8/HIF-1α/ET-1介導(dǎo)內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)；3、TRPM8可能通過降低iNOS表達(dá)、提高線粒體能量代謝、保護(hù)胞膜完整性在冷暴露中起保護(hù)作用；4、阿魏酸對 TRPM8表達(dá)呈雙向