原發(fā)性慢性腎小球腎炎CKD3期脾腎氣虛患者腸道菌群及其代謝組學研究.pdf

1、目的:
　　慢性腎臟疾病(chronic kideny disease，CKD)是一個全球性的醫(yī)學問題，近年來CKD的發(fā)病率逐年升高，嚴重威脅著人類的健康和生命。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷能夠有效地提高該病的治療效果，從而減輕個人和社會的負擔。因此，對CKD的深入研究，有助于闡明CKD發(fā)病機制，有助于早期診斷和提高療效，也有助于尋找新藥的作用靶點。
　　CKD的病因很多，包括腎小球疾病、腎小管間質疾病、腎血管疾病、代謝性疾病和結締組

2、織疾病性腎損害、感染性腎損害及先天性和遺傳性腎臟疾病等。在我國，CKD患病率約為9％-14％，病因以原發(fā)性慢性腎小球腎炎最為多見。當CKD進展至中后期，腎功能中到重度受損，腎臟排泄、分泌及調節(jié)等功能逐漸喪失，導致水電解質紊亂，酸堿平衡失調，氮質代謝產物和毒素潴留等癥狀。對于CKD的治療目前仍是世界醫(yī)學的難題，在診治過程中，我們發(fā)現(xiàn)CKD根據(jù)臨床分期的不同，均有其特點，分期論治可執(zhí)簡馭繁，事半功倍。而CKD3期是研究腎臟保護、延緩CKD進

3、展至終末期腎病(endstage of renal disease，ESRD)的關鍵時期。
　　CKD3期屬于中醫(yī)學“虛勞”、“水腫”、“腎風”等范疇。辨證多與脾、腎相關。CKD3期辨證屬于本虛標實、虛實夾雜之證，以本虛為主。根據(jù)2002《中藥新藥治療慢性腎功能衰竭的臨床研究指導原則》中的慢性腎功能衰竭的中醫(yī)證候診斷標準，將慢性腎衰竭分為正虛5型，包括脾腎氣虛型、脾腎陽虛型、肝腎陰虛型、氣陰兩虛型、陰陽兩虛型。研究表明，在CKD3

4、期患者中，脾腎氣虛型占53.7％-58％，脾腎陽虛型占13.75％-14.00％，肝腎陰虛型0％-20％，氣陰兩虛型占10％-28.00％，陰陽兩虛型占0％-2.5％。在CKD3期患者中，其中醫(yī)證型以脾腎氣虛型為主，說明脾腎氣虛能代表CKD3期一半左右的中醫(yī)證型，故本研究以脾腎氣虛患者為主要研究對象。
　　本研究旨在研究慢性腎臟病CKD3期脾腎氣虛患者腸道菌群以及尿液代謝組學與正常組的差異，研究慢性腎臟病CKD3期脾腎氣虛患者腸道

5、菌群及其代謝產物的變化，探討腸道菌群以及代謝產物的改變對慢性腎臟病發(fā)病以及病情進展的作用機制。
　　1.通過對體檢健康成年人以及慢性腎臟病CKD3期脾腎氣虛患者糞便中腸道菌群的測定，對比體檢健康成年人及慢性腎臟病CKD3脾腎氣虛期患者糞便菌群的差異。
　　2.通過檢測體檢健康成年人以及慢性腎臟病CKD3期脾腎氣虛患者的尿代謝組學，對比體檢健康成年人及慢性腎臟CKD3期患者代謝產物的差異。
　　方法:
　　本研究以

6、原發(fā)病為原發(fā)性慢性腎小球腎炎CKD3期脾腎氣虛患者為研究對象，觀察慢性腎小球腎炎CKD3期脾腎氣虛患者與正常對照組在腸道菌群以及代謝組學方面的差異。
　　本研究以13名原發(fā)性慢性腎小球腎炎CKD3期脾腎氣虛患者為實驗組，14名體檢健康人為對照組，進行腸道菌群測定，研究采用16S rRNA V4區(qū)域進行擴增和鑒定，并分析實驗組與對照組腸道菌群的差異。并以30名原發(fā)性慢性腎小球腎炎CKD3期脾腎氣虛患者為實驗組，30名體檢健康人為對照

7、組，利用LC-MS/MS檢測方法，分析實驗組與對照組在尿液代謝組學差異。
　　結果:
　　1.本研究共鑒定出腸道菌群微生物:門水平上，共鑒定出微生物所屬15門，其中具有顯著差異微生物有5門;綱水平上，共鑒定出微生物所屬33綱，其中存在顯著差異有9綱。目水平上，共鑒定出微生物所屬57目，其中存在顯著差異有20目。科水平，鑒定出微生物所屬87科，其中存在差異的有25科;在屬水平上，共鑒定出微生物所屬121屬，其中存在差異22屬;

8、種水平上，鑒定出微生物所屬61種，其中存在顯著差異有9種。將物種豐富極低的微生物排除，在統(tǒng)計學分析結果基礎上，得出，在門水平上，與對照組相比，實驗組酸桿菌門、綠彎菌門、互養(yǎng)菌門數(shù)量下調，疣微菌門數(shù)量上調。在綱水平上，與對照組相比，實驗組疣微菌綱數(shù)量上調。在目水平上，與對照組相比，實驗組巴斯德菌目、疣微菌目數(shù)量上調。在科水平，與對照組相比，疣微菌科、巴斯德氏菌科、腸桿菌科數(shù)量上調，理研菌科、Odoribacteraceae數(shù)量下調。在屬水

9、平上，與對照組相比，實驗組Akkermansia數(shù)量上調，嗜膽菌屬、Butyricimonas、糞球菌屬、小桿菌屬數(shù)量下調。在種水平上，與對照組相比，實驗組Desulfovibrio_D168數(shù)量上調。
　　2.本研究從代謝組水平，通過正離子以及負離子模式，分析出實驗組與對照組之間的差異代謝產物分別為502種和426種，所涉及的代謝路徑共136條，其中正離子途徑代謝產物的差異代謝路徑136條，負離子途徑代謝產物的差異代謝路徑99條

10、。這些代謝產物的差異代謝路徑主要涉及脂類、氨基酸類、糖類、核苷酸代謝以及一些特殊的信號通路等。
　　結論:
　　1.腸道菌群研究中，重點討論實驗組與對照組在科的水平的區(qū)別。研究發(fā)現(xiàn)，在科的水平，實驗組與對照組相比，理研菌科、Odoribacteraceae的數(shù)量較對照組下調，而疣微菌科、巴斯德氏菌科、腸桿菌科數(shù)量較對照組上調。目前關于疣微菌科、巴斯德氏菌科、Odoribacteraceae、理研菌科的研究相對較少。理研菌科微

11、生物包含的普雷沃氏菌屬，目前認為對于人體是一種益生菌。理研菌科微生物能夠參加正常的糖酵解過程，其利用氨基酸的能力低，不產生吲哚，不能還原硝酸鹽，產生神經(jīng)鞘脂。疣微菌科微生物屬于疣微菌門，是一門被劃出不久的細菌，主要被發(fā)現(xiàn)于水生和土壤環(huán)境，或者人類糞便中。其對于人體的作用目前尚不明確，許多研究表明，在病理狀態(tài)下，如肝硬化、克羅恩病等病理狀態(tài)下，腸道中疣微菌科的數(shù)量較正常組明顯升高。表明疣微菌科微生物可能參與人體的某些病理狀態(tài)。巴斯德氏菌科

12、微生物包括巴斯德氏菌屬、嗜血桿菌屬和放線桿菌屬，其中嗜血桿菌屬和放線桿菌屬屬于條件致病菌。研究表明，在慢性腎臟病過程中，由于腸道菌群失衡，條件致病菌的含量較正常組明顯上升。有研究者在各年齡段的健康人糞便中均可分離出Odoribacteraceae，提示其可能為健康機體所共有;同時，也有研究證實，從感染性傷口的膿液中也可分離鑒定出Odoribacteraceae，顯示其亦可能參與致病或具有條件致病性。本研究中實驗組Odoribactera

13、ceae數(shù)量低于對照組，其臨床意義尚需進一步分析。腸道中的腸桿菌科微生物的增多，腸桿菌科微生物是一類可以分解色氨酸產生吲哚，吲哚吸收入血后在肝臟中合成硫酸吲哚酚，硫酸吲哚酚是一種尿毒癥毒素，可以加速慢性腎臟病的進展。而腸桿菌科微生物的增多，同時導致腸道菌群的易位，腸道菌群的易位又能加重腎毒性代謝產物的產生，從而加重腎臟病的進展。
　　2.代謝組學研究表明，實驗組與對照組設計的差異代謝途徑包括脂類、氨基酸類、糖類、核苷酸代謝途徑，以