葡聚糖抗原制備、篩選及Elisa分析方法的建立.pdf

1、葡聚糖是豆粕、禾谷類常用動物飼料原料中的抗營養(yǎng)因子,也是制糖、啤酒工業(yè)的有害化學物,為了便于葡聚糖脫除方法的評價,實時監(jiān)控制糖、啤酒加工過程葡聚糖的形成情況,建立一種快速、準確的葡聚糖定量檢測方法十分必要。免疫分析法是根據(jù)抗體和抗原能發(fā)生特定結合而形成的分析方法,具有操作簡單,靈敏度高,選擇性強、不需要特殊儀器和設備等優(yōu)點。本研究以研究葡聚糖免疫抗原的合成,多克隆抗體制備及免疫分析技術為基礎,建立了一種快速簡便的葡聚糖的酶聯(lián)免疫檢測(E

2、lisa)方法。具體研究內(nèi)容如下：
　　 ⑴合成了不同氧化度的氧化葡聚糖半抗原,經(jīng)過紅外光譜和紫外光譜鑒定合成產(chǎn)物:采用還原胺化法,合成了不同的葡聚糖-BAS(HSA)人工抗原,優(yōu)化反應pH值、反應原料比、反應時間等反應條件,測定抗原的接枝度,SDS-PAGE對不同抗原進行定性與半定量表征;通過間接非競爭Elisa檢測抗原與葡聚糖一抗結合的效果,結果表明:半抗原的氧化度,葡聚糖的分子量和空間結構,載體蛋白對葡聚糖-BSA(HSA

3、)抗原與葡聚糖一抗結合的效果均有很大的影響。
　　 ⑵將葡聚糖與牛血清蛋白(BSA)以Maillard法合成葡聚糖-BSA抗原,抗原測定接枝度進行定量鑒定；通過間接非競爭Elisa檢測Maillard法制備的抗原與葡聚糖一抗結合率,結果表明:反應48h后的T100-BSA與一抗的結合率最強,即Maillard產(chǎn)物與葡聚糖一抗的結合率不僅與糖的分子量有關,并且與糖本身的特性、糖與蛋白質(zhì)結合產(chǎn)物的結構有關。
　　 ⑶通過免疫

4、新西蘭大白兔獲得的多抗以及Elisa試驗條件的優(yōu)化,建立了葡聚糖免疫定量檢測方法。最佳檢測條件為:抗原包被濃度10μg/mL,37℃時血清多抗和酶標多抗的反應時間均為45min,5％小牛血清為封閉液；用間接競爭Elisa方法,檢測不同分子量的葡聚糖對多抗的抑制。結果表明:不同分子量的葡聚糖均能對多抗血清產(chǎn)生抑制作用,且分子量越大的葡聚糖對多抗的抑制效果越明顯；同時市售的白糖對多抗也有一定的抑制作用,經(jīng)檢測可知,當白糖中葡聚糖T40的濃度