鹽芥ABI1和HKT1基因脅迫相關(guān)功能的研究.pdf

1、植物受到干旱、低溫和鹽等逆境境脅迫時(shí)，植物內(nèi)源 ABA濃度升高，環(huán)境信號(hào)通過(guò)一系列信使傳遞，并誘導(dǎo)多種基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的改變，而 ABA信號(hào)傳導(dǎo)通路是一條重要的與脅迫應(yīng)答相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，且植物激素 ABA在種子成熟萌發(fā)、植株生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)逆境脅迫應(yīng)答中也有關(guān)鍵調(diào)控作用。
　　ABA信號(hào)通路作為一個(gè)復(fù)雜的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，涉及多種正、負(fù)調(diào)控因子。通過(guò)對(duì)擬南芥的分子遺傳學(xué)研究，已鑒定出多種 ABA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的組分，包括蛋白激酶、

2、蛋白磷酸酶和多種轉(zhuǎn)錄因子等，其中Ser/Thr蛋白磷酸酶 PP2C家族成員在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中作為負(fù)調(diào)控因子起重要作用。目前，植物中發(fā)現(xiàn)的多種 PP2C類(lèi)磷酸酶均參與 ABA的信號(hào)傳導(dǎo)。
　　迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)擬南芥 PP2C家族的成員如 ABI1、ABI2、HAB1、HAG3和PP2CA等，它們均為ABA信號(hào)途徑負(fù)調(diào)控因子，其中ABI1是ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的核心組分。它們通過(guò)改變 ABA信號(hào)的強(qiáng)弱調(diào)控植物的脅迫應(yīng)答，從而影響與

3、ABA信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的植物表型和生理性狀，且認(rèn)為ABI1基因的表達(dá)水平可影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性。
　　鹽芥是與擬南芥近緣的植物耐逆分子遺傳學(xué)研究模式系統(tǒng)。因此對(duì)鹽芥 ThABI1基因的克隆以及對(duì)其功能、機(jī)理等方面的研究有助于進(jìn)一步深化對(duì)植物ABA信號(hào)途徑的認(rèn)識(shí)，從而更好地理解鹽芥耐脅迫機(jī)理，為植物的耐逆性改良奠定基礎(chǔ)。
　　本研究主要包括以下幾方面內(nèi)容:
　　1.鹽芥 ThABI1基因 cDNA全長(zhǎng)的克隆及序列分析。

4、
　　2.野生型鹽芥 ThABI1基因的耐逆研究:
　　干旱、鹽、冷和ABA處理野生型鹽芥后，實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè) ThABI1基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)以上脅迫條件下 ThABI1基因的表達(dá)水平均有不同程度的上調(diào)。
　　3.過(guò)量表達(dá)鹽芥 ThABI1研究其功能:
　　ThABI1全長(zhǎng)基因與帶有Basta篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301連接，構(gòu)建35S∷ThABI1過(guò)量表達(dá)載體，并導(dǎo)入農(nóng)桿菌后進(jìn)行鹽芥花序

5、侵染；0.2％Basta除草劑篩選鹽芥轉(zhuǎn)化子；對(duì)初篩的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定:PCR擴(kuò)增其 Bar基因(500bp)，其中7株獲得 PCR陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明35S∷ThABI1的pCAMBIA3301H過(guò)量表達(dá)載體已整合到野生型鹽芥的基因組。
　　4.鹽芥 ThABI1的基因沉默研究其功能:
　　將 ThABI1基因的部分序列(218bp)構(gòu)建 ThABI1∷pCAMBIA3301基因沉默表達(dá)載體；并導(dǎo)入農(nóng)桿菌后進(jìn)行鹽芥花序侵染

6、；0.2％Basta除草劑篩選鹽芥轉(zhuǎn)化子。
　　對(duì)初篩的鹽芥轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定:(1)PCR擴(kuò)增其 Bar基因(500bp)，其中6株獲得 PCR陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明 ThABI1∷pCAMBIA3301沉默載體已整合到鹽芥野生型的基因組；(2)鹽芥轉(zhuǎn)基因株系的實(shí)時(shí)定量 PCR分析發(fā)現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)基因株系 ThABI1基因表達(dá)水平與野生型相比有不同程度的降低；(3)60μmol/LABA分別處理轉(zhuǎn)基因植株0、3和6小時(shí)后，實(shí)時(shí)定量 PC

7、R檢測(cè) ThABI1基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株中ABI1基因的表達(dá)水平受 ABA誘導(dǎo)上調(diào)。說(shuō)明 ThABI1參與了植株對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)，且對(duì)干旱和外源 ABA誘導(dǎo)較敏感；ThABI1的進(jìn)一步分子鑒定和功能研究仍在進(jìn)行中。
　　5.擬南芥 AtHKT1啟動(dòng)子∷ThHKT1轉(zhuǎn)基因植株的耐逆研究:
　　對(duì)擬南芥 AtHKT1啟動(dòng)子∷ThHKT1轉(zhuǎn)基因純合子植株(宋開(kāi)俠師姐獲得)進(jìn)行以下分析:(1)0、75、125 mmol

8、/L不同濃度 NaCl分別處理擬南芥 HKT1突變體(sas2-1)、野生型和擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，分別測(cè)定其植株的Na+、K+含量，結(jié)果表明較之于野生型，轉(zhuǎn)基因植株和sas2-1地上部分均積累更多 Na+，但 sas2-1表現(xiàn)更加明顯，說(shuō)明鹽脅迫條件下AtHKT1啟動(dòng)子∷ThHKT1的轉(zhuǎn)基因植株可減少 Na+轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入擬南芥 sas2-1地上部分；(2)0、50、100 mmol/L不同濃度 KCl分別處理擬南芥轉(zhuǎn)基因植株、野生型及sas2