鹽芥氧化還原相關(guān)基因DHAR和Fe-SOD的功能研究.pdf

1、鹽芥—擬南芥的近親，具有非常強(qiáng)的耐鹽能力，能夠耐受500mM氯化鈉的沖擊。分析植物的耐鹽機(jī)理大致可以分為一下四類：一是泌鹽，如中華補(bǔ)血草，其通過(guò)特殊的生理結(jié)構(gòu)一鹽腺，將體內(nèi)多余的鹽分分泌排出體外，以維持體內(nèi)低鹽環(huán)境；二是離子區(qū)域化，如鹽地堿蓬，其肉質(zhì)化的葉和莖意味著細(xì)胞中液泡將細(xì)胞質(zhì)中的鹽離子大量泵入液泡內(nèi)以維持細(xì)胞質(zhì)的離子穩(wěn)態(tài)：三是超強(qiáng)的抗氧化能力，細(xì)胞內(nèi)離子濃度的異常增高通常會(huì)引起活性氧的增加，活性氧的活躍會(huì)危害生物大分子如蛋白質(zhì)，

2、核酸的功能，植物細(xì)胞通過(guò)積累大量的還原性物質(zhì)如抗壞血酸，以中和活性氧，或者通過(guò)酶促反應(yīng)清除活性氧，減少活性氧對(duì)細(xì)胞的危害，主要的酶包括各類CAT，POD，SOD，MDAR等；四是滲透保護(hù)物質(zhì)，如脯氨酸，甜菜堿等小分子有機(jī)物質(zhì)，它們可減少細(xì)胞因胞內(nèi)高離子濃度引起的細(xì)胞失水而保護(hù)細(xì)胞。 鹽芥由于不具備形態(tài)學(xué)上的特殊結(jié)構(gòu)——鹽腺和肉質(zhì)化的莖葉，而不能通過(guò)泌鹽和離子區(qū)域化抗鹽。所以我們推測(cè)其較強(qiáng)的抗鹽能力是源于其超強(qiáng)的抗氧化能力和迅速

3、積累滲透保護(hù)物質(zhì)的能力。在此，我們主要從抗氧化能力的角度去研究探討鹽芥的耐鹽機(jī)理。 本論文的思路如下：找出最為活躍的活性氧清除酶類，用RNAi的方法將其knockdown，以觀察植物耐鹽能力的變化。所以我們實(shí)驗(yàn)的第一步是找到我們研究的靶基因，我們從Genbank中找到鹽芥基因的EST，從中篩選出活性氧清除酶類，設(shè)計(jì)引物，分別以正常生長(zhǎng)條件下的鹽芥和鹽處理的鹽芥的RNA為模板進(jìn)行Realtime PCR，以期找到鹽處理前后轉(zhuǎn)錄變

4、化最大的基因。令我們失望的是我們選取的各基因?qū)}處理的反應(yīng)方向和變化幅度都非常接近。所以，我們挑選了變化幅度最大的DHAR和FeSOD作為我們接下來(lái)的研究對(duì)象。我們從這兩個(gè)基因的EST序列中選取大約300bp作為沉默的靶向序列。將沉默表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌后通過(guò)點(diǎn)花浸染鹽芥。經(jīng)除草劑篩選后先用PCR的方法進(jìn)行分子鑒定，以確認(rèn)轉(zhuǎn)基因成功。再用Northem bolting的方法檢測(cè)沉默的效果，待確認(rèn)靶向基因被沉默以后檢測(cè)植株的耐鹽能力與野生型

5、相比有無(wú)變化，有多大程度的變化，從而得出鹽芥活性氧清除系統(tǒng)對(duì)其抗鹽能力貢獻(xiàn)大小的初步結(jié)論。由于植物的抗氧化系統(tǒng)比較復(fù)雜：機(jī)理分酶促和非酶促兩種，酶促機(jī)制中的功能分子多種多樣：有CAT、POD、SOD、DHAR、MDAR五大類，而SOD又可以根據(jù)其金屬輔基的不同分為Cu—ZnSOD、FeSOD、MnSOD。所以單個(gè)基因的沉默并不能引起植物抗氧化能力在很大程度上的改變，這從我們的實(shí)驗(yàn)中可以看出：DHAR和FeSOD的沉默沒(méi)有引起鹽芥耐鹽能力