脂肪酸延長酶ELO家族與脂毒關系研究.pdf

1、當長鏈脂肪酸的積累超過脂肪組織的儲存能力，會在非脂肪組織過度沉積，造成脂毒，進而引發(fā)脂毒性凋亡，是多種代謝性疾病的主要病因。脂肪酸延長酶家族參與脂肪酸代謝流，且與膜脂的代謝密切相關。但脂肪酸延長酶與脂毒關系并不清楚。酵母脂肪酸延長酶ELO家族包括Elo1、Elo2、Elo3，其中Elo2和Elo3負責將長鏈脂肪酸延長到極長鏈脂肪酸，并參與細胞多項生命活動和功能的調節(jié)，在真核生物中有很高的保守性，因此選擇酵母研究相關機制是很好的模型。

2、r>　　本文首先建立了油紅O比色快速檢測酵母中性脂含量的方法。利用油紅O比色法和薄層層析法分析野生型BY4741和脂肪酸延長酶缺陷菌株脂質含量，發(fā)現elo缺陷菌株中性脂含量積累。油酸處理后，胞內中性脂含量升高。采用氣相色譜-質譜聯用技術分析脂肪酸組成，結果顯示 ELO3敲除后，C26脂肪酸基本檢測不到，而 C20與 C22脂肪酸會累積；ELO2缺失后，C26脂肪酸的含量也明顯降低。而油酸的處理會增加BY4741胞內總的極長鏈脂肪酸的比例

3、。油酸處理后， elo2△和elo3△的不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例增大。
　　極長鏈脂肪酸延長酶ELO2和ELO3缺陷后，細胞對油酸高度敏感。而ELO1突變株無油酸敏感表型。同時加入抗氧化劑VC或NAC，能有效補救油酸造成突變株的生長抑制。利用 DCFH-DA檢測胞內ROS水平，顯示油酸處理后elo2△和elo3△胞內ROS含量積累。接下來對胞內抗氧化酶活性及抗氧化劑含量的進行測定，顯示油酸處理后野生型及elo1△胞內抗氧化酶

4、活性升高，而elo2△和elo3△胞內的CAT和SOD酶活性急劇降低；油酸處理后，還原型谷胱甘肽GSH含量均降低。通過對胞內MDA及PCO含量的測定，顯示油酸處理后其含量均升高，表明油酸對酵母細胞造成了氧化損傷。尤其是elo2△和elo3△胞內MDA含量的升高有極顯著性差異。elo2△和elo3△對兩性霉素 B等抗生素具有高度敏感性。對其麥角固醇含量的檢測，顯示含量低于野生型酵母菌株。利用 PI染色檢測細胞膜的通透性，發(fā)現elo2△和e

5、lo3△的膜通透性明顯高于野生型細胞，且油酸處理后膜通透性顯著提高。結果表明極長鏈脂肪酸延長酶的缺失不僅引起細胞內脂肪酸組成的變化，抗油酸誘導的氧化能力下降，同時還導致膜脂麥角固醇含量降低，細胞膜穩(wěn)定性下降。
　　通過構建elo3△背景的酵母必需基因超表達文庫，在高濃度油酸培養(yǎng)基上篩選抵抗油酸脅迫的菌株。經過質粒測序得到一系列油酸響應基因，包括復制起始因子，參與復制修復、mRNA剪接的亞基，參與泛素化降解的ATP酶，及參與合成血紅