南方鲇(Silurus meridionalis)Ghrelin基因克隆及其mRNA表達研究.pdf

1、Ghelin為生長激素促分泌受體第一個內源性配體。是一條N末端第三個氨基酸被脂肪酸鏈修飾的含有28個氨基酸的核酸多肽,最早是由Kojima在小鼠胃中發(fā)現(xiàn)。Ghrelin的發(fā)現(xiàn)擴展了它在脊椎動物調節(jié)能量動態(tài)平衡中的作用,研究硬骨魚類發(fā)現(xiàn),GRln除在胃中高量表達外,在大腦、胰腺、膀胱、腸和鰓中也廣泛表達。這種廣泛性表達使其功能呈現(xiàn)多樣性,從而呈現(xiàn)出一系列的生物學作用。Ghrelin不僅能夠刺激魚類生長激素的釋放,提高攝食量、引起肥胖等生物

2、學作用,還能影響多種激素釋放以及調節(jié)GH/IGF-1軸。它的生物學作用主要通過與體內的內源性配體生長激素促分泌素受體-1a(GHSR-1a)相結合而實現(xiàn)。
　　 本研究以南方鲇為實驗對象,運用RACE(Rapid amplification of cDNA end)技術成功克隆了南方鲇Ghrelin基因cDNA的全長序列,并根據堿基序列翻譯出Ghrelin的氨基酸序列,進而預測其蛋白質的基本物理性質及高級結構。另外,本研究還使用

3、熒光定量PCR技術(QRT-PCR)檢測南方鲇各種組織(腦、胃、肝、腎、心臟、鰓、腸)、發(fā)育階段(受精卵、囊胚,原腸胚,神經胚和出膜)和不同攝食水平下Ghrelin的表達水平,為后續(xù)研究Ghrelin的生物學功能提供理論依據。
　　 通過RACE技術,成功的克隆了南方鲇Ghrelin全長cDNA序列。GhrelincDNA序列全長473bp,包括327bp編碼區(qū)(ORF),以及一段長度為45bp5'端非翻譯區(qū)(UTR)和101b

4、p3'端非翻譯區(qū)。南方鲇Ghrelin成熟肽含有22個氨基酸(“GSSFLSPSQRPQNRGDRKPPRV”)。通過對Ghrelin氨基酸的同源性比對,結果顯示成熟Ghrelin多肽的N端要比C端更保守,主要為“GSSFLSP”7個氨基酸,其中“GSSF”4個氨基酸推測可能為Ghrelin的生物活性中心。比對結果還顯示Ghrelin氨基酸同硬骨魚類具有40%-81%的相似性,同哺乳動物、鳥類、爬行類、兩棲類具有32%-38%的相似性。

5、在經過由低級向高級的進化過程中,4個位點在硬骨魚類、兩棲動物、爬行類、鳥類和哺乳類依然保留,說明此位點在生命活動中扮演重要的角色。
　　 經過QPCR對南方鲇各組織的表達分析,我們發(fā)現(xiàn)Ghrelin在胃、腸中的含量相對較為豐富,這和以往研究Ghrelin在胃的基部產生相一致,從側面可以反映Ghrelin在攝食過程中可能起到某種生物學作用。對南方鲇不同早期發(fā)育時期檢測Ghrelin的含量變化發(fā)現(xiàn),在出膜前Ghrelin的含量相對豐

6、富,在其余不同的發(fā)育時期均微量表達,并隨著時間的推移,呈上升趨勢,特別卵黃消耗殆盡出膜前,Ghrelin含量明顯升高,說明,南方鲇在出膜后各器官對營養(yǎng)供給做出重要應對機制,為食物由內源性向外源性轉變做好準備,Ghrelin在對外源性食物調節(jié)作用中起更重要的作用,但調節(jié)內源性食物作用有限。對南方鲇不同攝食水平檢測發(fā)現(xiàn),在攝食后0小時,Ghrelin含量最高,攝食2小時后迅速降低,此時南方鲇胃中食物幾乎還沒有消化,我們據此推斷,Ghreli

7、n在攝食過程中的生物學作用可能僅為饑餓信號。在南方鲇饑餓48小時后,檢測Ghrelin的含量最高,然后隨饑餓時間的延長,反而呈下降趨勢。經過饑餓2周后,當再攝食4小時候后,Ghrelin含量又迅速降低,再攝食24小時后,Ghrelin的含量恢復到饑餓24小時Ghrelin含量的50%。綜上我們推測Ghrelin調節(jié)攝食是一個短期調節(jié)過程,并且Ghrelin的分泌可能受胃組織結構、生理功能的影響以及分解代謝的抑制等。
　　 綜上所