狼瘡性腎炎中醫(yī)證型及血漿外泌體microRNA表達(dá)譜的生物信息研究.pdf

1、目的:
　　1.臨床研究
　　探討狼瘡性腎炎患者年齡及性別、臨床分型、病理類型及活動性指數(shù)等的分布情況，比較其中醫(yī)主證虛、實證之間的上述指標(biāo)及臨床理化相關(guān)指標(biāo)、免疫相關(guān)指標(biāo)、炎癥相關(guān)指標(biāo)、尿液相關(guān)指標(biāo)等的差異，以此來分析二者與疾病活動的相關(guān)性，為臨床虛、實證的判定及分期論治提供客觀依據(jù)。
　　2.實驗研究
　　研究脾腎陽虛型狼瘡性腎炎血漿外泌體microRNA表達(dá)譜與健康志愿者的差異，對差異表達(dá)的分子行靶基因預(yù)測

2、及生物通路和基因功能富集分析，找出靶基因的富集功能及調(diào)控的信號通路，以探索狼瘡性腎炎可能的發(fā)生發(fā)展機制;篩選出差異表達(dá)的microRNA分子，以期能發(fā)現(xiàn)具有良好應(yīng)用前景的可用于輔助診斷的生物標(biāo)志物;探討差異表達(dá)的microRNA分子與狼瘡性腎炎脾腎陽虛證型可能存在的相關(guān)性，為中醫(yī)辨證提供分子生物學(xué)方面的客觀依據(jù)。
　　方法:
　　1.臨床研究
　　回顧性調(diào)查2010年1月至2015年12月于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎

3、內(nèi)科住院的符合診斷標(biāo)準(zhǔn)、納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)的狼瘡性腎炎患者，按照首次腎活檢時記錄的癥狀體征，將其分為熱毒熾盛證、肝腎陰虛證、氣陰兩虛證、脾腎氣虛證、脾腎陽虛證五型，其中熱毒熾盛證納入實證組，其余四種證型納入虛證組。收集患者年齡及性別等一般情況、臨床分型、病理分型、活動性指數(shù)、免疫相關(guān)指標(biāo)及臨床相關(guān)理化指標(biāo)等資料，應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行分析，并比較虛、實證兩組患者上述指標(biāo)的差異。
　　2.實驗研究
　　選取脾腎陽虛型狼瘡性腎炎患

4、者及健康志愿者各3名，應(yīng)用Exoquick試劑提取血漿外泌體，采用高通量測序方法測定兩組外泌體的microRNA表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)的microRNA分子行靶基因預(yù)測，進(jìn)一步對預(yù)測的靶基因行KEGG Pathway生物通路分析及GO基因功能富集分析，找出靶基因的富集功能及其調(diào)控的信號通路。
　　結(jié)果:
　　1.臨床研究
　　本研究共納入患者134例，女性患者117例，男性患者僅17例，男女比例約1∶6.9。中醫(yī)主證以

5、脾腎氣虛證患者最多，共41例，所占比例約30.6％;其次為熱毒熾盛證及脾腎陽虛證，二者均有33例患者，各占24.63％;之后依次為肝腎陰虛證患者14例(10.45％)，氣陰兩虛證患者13例(9.70％)。實證組患者33例，虛證組患者101例。
　　(1)性別、年齡等一般情況:實證組中男性2例，女性31例;年齡最小12歲，最大45歲，平均年齡(27.76±10.80)歲。虛證組中男性15例，女性86例;年齡最小10歲，最大60歲，平

6、均年齡(30.68±12.07)歲。兩組患者的年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。說明狼瘡性腎炎患者虛、實證的發(fā)病與性別及年齡均無明顯相關(guān)性。
　　(2)臨床分型:臨床分型中以腎病綜合征為最多見，共59例(44.03％)，其次為慢性腎炎型48例(35.82％)，之后依次為隱匿性腎炎型12例(8.96％)，慢性腎衰竭型11例(8.21％)，急進(jìn)性腎炎型4例(2.98％)。虛、實證兩組患者的臨床分型分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但實證組

7、患者以慢性腎炎型為最多，而虛證組患者以腎病綜合征為最多。急進(jìn)性腎炎均見于虛證組，且主要為脾腎陽虛證。
　　(3)病理相關(guān)指標(biāo):病理類型中以Ⅳ型為最多見，共50例(37.31％)，其次為Ⅴ型23例(17.16％)，之后依次為Ⅴ+Ⅳ型20例(14.93％)，Ⅱ型17例(12.69％)，Ⅰ型12例(8.96％)，Ⅲ型7例(5.22％)，Ⅴ+Ⅲ型3例(2.24％)，Ⅵ型2例(1.49％)。虛、實證兩組患者的病理類型分布及AI比較，差異無統(tǒng)

8、計學(xué)意義;虛證組的CI明顯高于實證組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(4)臨床理化指標(biāo):兩組患者的血常規(guī)相關(guān)指標(biāo)比較，WBC、LYM、RBC及HGB的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。虛證組患者WBC及LYM計數(shù)均顯著高于實證組，RBC及HGB則顯著低于實證組;兩組患者的腎功能相關(guān)指標(biāo)比較，BUN、UA及CysC差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而Cr水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異。虛證組患者的BUN、UA及CysC水平均顯著高于實證組患者;兩組患者的肝功能相關(guān)指標(biāo)比較，A

9、ST的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而ALT、ALB及G的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。虛證組患者的AST水平顯著高于實證組。
　　(5)免疫相關(guān)指標(biāo):所有患者ANA全部為陽性，而ds-DNA陽性患者113例(84.33％)。抗ENA抗體譜中，以抗SSA抗體陽性者為最多，共79例(58.96％)。其次是抗Sm抗體陽性者77例(57.46％)，其后為抗核小體抗體(AnuA)陽性者73例(54.48％)，之后依次為抗組蛋白抗體(AHA)陽性者58例(43.

10、28％)，抗nRNP抗體陽性者42例(31.34％)，抗rRNP抗體陽性患者38例(28.36％)，抗SSB抗體陽性者34例(25.37％)，抗SCL-70抗體陽性者5例(3.73％)，抗J0-1抗體陽性者僅1例(0.75％)，未發(fā)現(xiàn)抗著絲點抗體陽性患者。虛、實證兩組患者的各抗體陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義;兩組患者自免五項相關(guān)指標(biāo)比較，包括ANA滴度、dsDNA滴度、CIC、C3及C4比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(6)炎癥指

11、標(biāo):部分患者未行CRP及ESR的檢測，故實際納入統(tǒng)計的實證組共20例，虛證組共64例。兩組的CRP及ESR比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(7) SLEDAI積分:在收集的134例患者中，SLEDAI積分最高的為40分，最低的為2分，平均(13.39±0.48)分。病情處于重度活動期的患者62例(46.27％)，中度活動期的患者36例(26.86％)，輕度活動期患者28例(20.9％)，非活動期患者8例(5.97％)。虛、實證兩組患

12、者中，各自也均以重度活動期患者為最多見，其次為中度活動期患者，之后依次為輕度活動期、非活動期患者。兩組患者的SLEDAI積分及其分期比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(8)尿液相關(guān)指標(biāo):在收集的134例患者中，尿蛋白陽性患者共128例，占95.52％，其中以尿蛋白3+為最多見，共95例(70.9％)，尿蛋白陰性患者僅6例;而尿隱血陽性患者共115例，占85.82％，也是以尿隱血3+為最多，共77例患者(57.46％)，尿隱血陰性患者

13、僅19例。兩組患者的尿蛋白定性、尿隱血及尿蛋白定量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.實驗研究
　　(1)脾腎陽虛型狼瘡性腎炎患者與健康志愿者血漿外泌體的microRNA表達(dá)譜分析比較，共篩選出148個差異表達(dá)的microRNA分子，其中上調(diào)表達(dá)的131個，而下調(diào)表達(dá)的僅17個。具有高顯著差異的共2個，分別為hsa-miR-127-3p及hsa-miR-4497;一般顯著差異的共6個，分別為hsa-miR-129-5p、hs

14、a-miR-383-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-629-3p、hsa-miR-3158-3p及hsa-miR-3184-3p;其余140個均為一般差異。
　　(2)在表達(dá)差異顯著的8個microRNA分子中，共預(yù)測出1664個靶基因，其中hsa-miR-629-3p預(yù)測到的靶基因最多，共439個，而hsa-miR-127-3p預(yù)測的數(shù)量最少，僅8個。Hsa-miR-3158-3p為表達(dá)下調(diào)的miRNA分子，

15、其預(yù)測到的靶基因共205個。
　　(3)靶基因經(jīng)KEGG生物通路分析，得到具有統(tǒng)計學(xué)意義的信號及疾病通路共19個。其中以FoxO信號通路及TGF-β信號通路意義最為顯著。
　　(4)靶基因經(jīng)GO基因功能富集分析，得到具有統(tǒng)計學(xué)意義的GO功能共108個。其功能主要體現(xiàn)在細(xì)胞自噬及調(diào)控基因表達(dá)、生物合成、轉(zhuǎn)錄因子活性等方面。
　　結(jié)論:
　　1.臨床研究
　　(1)狼瘡性腎炎患者中醫(yī)主證以脾腎兩虛為最多見，包括

16、脾腎氣虛證及脾腎陽虛證;臨床分型中以腎病綜合征為最多見，其次為慢性腎炎型;病理類型則以Ⅳ型為主，其次為Ⅴ型及Ⅴ+Ⅳ型;病情以重度活動期為主。
　　(2)狼瘡性腎炎患者虛、實證的發(fā)病與性別及年齡均無明顯相關(guān)性。
　　(3)實證組與虛證組患者臨床分型、病理類型、自免五項、抗ENA抗體譜、SLEDAI積分、炎癥指標(biāo)及尿液相關(guān)指標(biāo)比較，均無明顯差異。實證、虛證與疾病活動性并無明顯相關(guān)。
　　(4)虛證組的CI、WBC、LYM、

17、BUN、UA、CysC及AST等指標(biāo)顯著高于實證組，而RBC及HGB則顯著低于實證組。說明虛證組腎功能損傷程度及貧血程度均重于實證組，腎臟的慢性損害程度也重于實證組。
　　2.實驗研究
　　(1)Hsa-miR-127-3p及hsa-miR-4497兩個分子在脾腎陽虛型狼瘡性腎炎中表達(dá)顯著升高，可能對輔助其診斷及辨證具有一定的意義，但需進(jìn)一步的研究來驗證。
　　(2)FoxO信號通路及TGF-β信號通路可能在LN的發(fā)病