狼瘡性腎炎腎陰虛證DNA消減文庫的構(gòu)建.pdf

1、目的：建立抑制性消減雜交方法以篩選人白細胞中的差異基因，并檢驗其篩選效能。構(gòu)建狼瘡性腎炎腎陰虛證DNA消減文庫。 方法：首先參照Akopyants等方法建立抑制性消減雜交法以篩選人血白細胞中人基因組的差異基因，并檢驗其篩選效能：選健康的漢族人抽取靜脈血(抗凝)2ml，提取白細胞基因組DNA。將DNA分為兩份，其中一份加入10ng質(zhì)粒pUCm-T作為實驗方(Tester)，此經(jīng)RsaⅠ酶切的質(zhì)粒pUCm-TDNA片段作為所要篩選的

2、差異基因。然后從狼瘡性腎炎腎陰虛證入手，按美國風濕病協(xié)會1982年系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷標準，選取漢族人確診為系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者，狼瘡患者有下列任一項腎受累表現(xiàn)者即可診斷為狼瘡腎炎：1、蛋白尿＞0.5g/24hr；2、血尿RBC＞5個HPF離心尿3、腎功能下降；4、腎小管功能異常；5、腎活檢異常。確診為狼瘡性腎炎患者，依據(jù)腎虛證診斷標準，辨證為腎陰虛證患者，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)—抑制性消減雜交(suppressionsubtractive

3、hybridization，SSH)、聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)、基因克隆(geneclone)等方法構(gòu)建狼瘡性腎炎腎陰虛證的正、反向DNA消減文庫，再運用斑點雜交原理(dotblot)去除假陽性克隆，從而構(gòu)建狼瘡性腎炎腎虛證DNA消減文庫。隨機抽取陽性克隆進行測序，測序后使用以下基因庫http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/進行序列的同源性分析以驗證該文庫是否含

4、有基因片段。 結(jié)果：本實驗成功將經(jīng)RsaⅠ酶切的質(zhì)粒pUCm-TDNA片段篩選出來，說明建立的篩選復(fù)雜基因組中差異基因的SSH方法是成功的，可用于構(gòu)建狼瘡性腎炎腎陰虛證DNA消減文庫。首次成功地構(gòu)建了漢族人LN腎陰虛證的DNA消減文庫，經(jīng)籃白斑篩選后，正向消減文庫得到295個克隆，反向消減文庫得到286個克隆。經(jīng)過點雜交(dotblot)進一步篩選陽性克隆，分別從正向文庫和反向文庫中各抽取5個陽性克隆，進行測序及同源性分析，結(jié)果

5、發(fā)現(xiàn)正向文庫中有1個克隆測序不成功，1個克隆為DNA重復(fù)序列，其他3個克隆涉及到免疫(白介素18受體、白介素10)以及未知功能的基因。反向文庫有1個克隆測序不成功，1個克隆為DNA重復(fù)序列，1個克隆未見有同源基因，其他2個克隆分別為p40以及未知功能的基因等。 結(jié)論：我們成功建立了能夠篩選出兩個DNA消減文庫中的差異DNA片段的方法，該法具有效率高、易篩選、易操作、靈敏性高、特異性高等優(yōu)點，有利于對低拷貝差異基因的克隆。雖然有對

6、起始材料要求較多，對完全無酶切位點的基因組無法篩選等不足，仍為篩選差異基因較好的方法，十分適用于克隆分析造成某種特殊表型的目的基因及其功能，為進一步克隆腎陰虛證的相關(guān)基因提供了新的手段。成功地構(gòu)建了LN腎陰虛證的DNA文庫，經(jīng)同源性分析，初步證實該庫含有基因片段，由于這些DNA片段僅為基因的部分片段，所以尚不能確定這些基因是否為LN腎陰虛證的相關(guān)基因。本實驗為進一步克隆腎陰虛證相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)，下一步應(yīng)利用本實驗方法構(gòu)建多個病種腎陰虛證