狼瘡性腎炎腎陰虛證DNA消減文庫的構(gòu)建.pdf

1、目的：建立抑制性消減雜交方法以篩選人白細(xì)胞中的差異基因，并檢驗(yàn)其篩選效能。構(gòu)建狼瘡性腎炎腎陰虛證DNA消減文庫。 方法：首先參照Akopyants等方法建立抑制性消減雜交法以篩選人血白細(xì)胞中人基因組的差異基因，并檢驗(yàn)其篩選效能：選健康的漢族人抽取靜脈血(抗凝)2ml，提取白細(xì)胞基因組DNA。將DNA分為兩份，其中一份加入10ng質(zhì)粒pUCm-T作為實(shí)驗(yàn)方(Tester)，此經(jīng)RsaⅠ酶切的質(zhì)粒pUCm-TDNA片段作為所要篩選的

2、差異基因。然后從狼瘡性腎炎腎陰虛證入手，按美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1982年系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取漢族人確診為系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者，狼瘡患者有下列任一項(xiàng)腎受累表現(xiàn)者即可診斷為狼瘡腎炎：1、蛋白尿＞0.5g/24hr；2、血尿RBC＞5個(gè)HPF離心尿3、腎功能下降；4、腎小管功能異常；5、腎活檢異常。確診為狼瘡性腎炎患者，依據(jù)腎虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)，辨證為腎陰虛證患者，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)—抑制性消減雜交(suppressionsubtractive

3、hybridization，SSH)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)、基因克隆(geneclone)等方法構(gòu)建狼瘡性腎炎腎陰虛證的正、反向DNA消減文庫，再運(yùn)用斑點(diǎn)雜交原理(dotblot)去除假陽性克隆，從而構(gòu)建狼瘡性腎炎腎虛證DNA消減文庫。隨機(jī)抽取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后使用以下基因庫http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/進(jìn)行序列的同源性分析以驗(yàn)證該文庫是否含

4、有基因片段。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)成功將經(jīng)RsaⅠ酶切的質(zhì)粒pUCm-TDNA片段篩選出來，說明建立的篩選復(fù)雜基因組中差異基因的SSH方法是成功的，可用于構(gòu)建狼瘡性腎炎腎陰虛證DNA消減文庫。首次成功地構(gòu)建了漢族人LN腎陰虛證的DNA消減文庫，經(jīng)籃白斑篩選后，正向消減文庫得到295個(gè)克隆，反向消減文庫得到286個(gè)克隆。經(jīng)過點(diǎn)雜交(dotblot)進(jìn)一步篩選陽性克隆，分別從正向文庫和反向文庫中各抽取5個(gè)陽性克隆，進(jìn)行測(cè)序及同源性分析，結(jié)果

5、發(fā)現(xiàn)正向文庫中有1個(gè)克隆測(cè)序不成功，1個(gè)克隆為DNA重復(fù)序列，其他3個(gè)克隆涉及到免疫(白介素18受體、白介素10)以及未知功能的基因。反向文庫有1個(gè)克隆測(cè)序不成功，1個(gè)克隆為DNA重復(fù)序列，1個(gè)克隆未見有同源基因，其他2個(gè)克隆分別為p40以及未知功能的基因等。 結(jié)論：我們成功建立了能夠篩選出兩個(gè)DNA消減文庫中的差異DNA片段的方法，該法具有效率高、易篩選、易操作、靈敏性高、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，有利于對(duì)低拷貝差異基因的克隆。雖然有對(duì)

6、起始材料要求較多，對(duì)完全無酶切位點(diǎn)的基因組無法篩選等不足，仍為篩選差異基因較好的方法，十分適用于克隆分析造成某種特殊表型的目的基因及其功能，為進(jìn)一步克隆腎陰虛證的相關(guān)基因提供了新的手段。成功地構(gòu)建了LN腎陰虛證的DNA文庫，經(jīng)同源性分析，初步證實(shí)該庫含有基因片段，由于這些DNA片段僅為基因的部分片段，所以尚不能確定這些基因是否為L(zhǎng)N腎陰虛證的相關(guān)基因。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步克隆腎陰虛證相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)，下一步應(yīng)利用本實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建多個(gè)病種腎陰虛證