糖尿病腎陰虛證cDNA消減文庫的構(gòu)建.pdf

1、[背景]辨證論治是中醫(yī)學(xué)診治疾病的基礎(chǔ)，也是中醫(yī)學(xué)最有特色的科學(xué)精華。證是辨證論治的前提和基礎(chǔ)，是將中醫(yī)基礎(chǔ)理論與臨床治療體系緊密連接起來的橋梁。幾十年有關(guān)證的本質(zhì)的研究中，世界醫(yī)學(xué)界眾多學(xué)者運用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和方法，初步證實“證”具有現(xiàn)代病理生理學(xué)基礎(chǔ)。隨著研究的深入，同時也帶來了困惑和迷茫。中醫(yī)“證”是疾病發(fā)生過程中不同階段病因病機(jī)的高度概括，同一證有共同的臨床表現(xiàn)和病理機(jī)制，那么證一定有共同的物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)生命的中心法則：基因型(D

2、NA或基因)處于最原始和最本質(zhì)的地位，主宰和制約表型(蛋白質(zhì)→細(xì)胞→有機(jī)體)程序的發(fā)生發(fā)展。因此，生命現(xiàn)象、疾病、中醫(yī)證候都可以從DNA或基因水平的研究獲得最本質(zhì)的答案。中醫(yī)認(rèn)為腎為先天之本，腎所藏之精為先天之精，與生俱來，源于父母的生殖之精，是構(gòu)成胚胎發(fā)育的原始物質(zhì)，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)描述的遺傳物質(zhì)(即基因組)具有一定的同一性。腎虛證的物質(zhì)基礎(chǔ)是腎精虧虛。國內(nèi)許多專家教授認(rèn)為人類基因組學(xué)研究的方法學(xué)內(nèi)容與中醫(yī)學(xué)的整體觀、辨證觀有許多相似之處，

3、而且功能基因組學(xué)研究更能準(zhǔn)確反應(yīng)中醫(yī)證候的變化，對功能基因組學(xué)的研究將是中醫(yī)學(xué)現(xiàn)代化研究的重大突破口。因此，從功能基因組方面研究腎虛證的分子機(jī)制對于闡明腎虛證本質(zhì)有重要意義。 現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展為中醫(yī)理論的現(xiàn)代化研究提供了必要的技術(shù)平臺，用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論逐步闡明中醫(yī)證的本質(zhì)是十分必要的，也是切實可行的。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病具有明顯的易感基因，它是一種與環(huán)境和遺傳因素有關(guān)的多基因遺傳疾病，近年來對糖尿病的研究結(jié)果顯示腎虛可能始

4、終貫穿于糖尿病發(fā)生、發(fā)展的整個過程中，因此，我們認(rèn)為從糖尿病這一病種入手，首先構(gòu)建糖尿病腎陰虛證的相關(guān)基因文庫，進(jìn)一步研究腎陰虛證相關(guān)基因，是比較理想的切入點。 [目的]構(gòu)建糖尿病腎陰虛證的cDNA消減文庫。 [方法]1.用TRIzol抽提總RNA，用SMART技術(shù)擴(kuò)增微量RNA，用Chromaspin-1000純化擴(kuò)增的cDNA，用RsaⅠ或HaeⅢ酶切cDNA。 2.抑制性消減雜交方法(SSH)的建立取正常組

5、擴(kuò)增的4μgcDNA將其分為兩份，其中一份2μgcDNA作為驅(qū)動方(Driver)，而另一份2μgcDNA加入0.2ng質(zhì)粒ψX174作為實驗方(Tester)。用應(yīng)用HaeⅢ酶切制備驅(qū)動子、檢測子，此經(jīng)HaeⅢ酶切的質(zhì)粒ψX174DNA片段作為所要篩選的差異基因，連接不同接頭，經(jīng)過兩次消減雜交，兩次PCR擴(kuò)增，建立SSH方法。并依據(jù)目標(biāo)cDNA與背景cDNA(假陽性產(chǎn)物)間的以下差異為基礎(chǔ)的：各種背景克隆分子只單向?qū)?yīng)于SSH中兩種不

6、同側(cè)翼接頭序列中的一種，而目標(biāo)cDNA片斷同時具有兩種側(cè)翼接頭序列，在SSH基礎(chǔ)上進(jìn)行鏡像選擇(mirrororientationselection,MOS)，以去除常規(guī)SSH方法的背景分子，提高消減文庫的質(zhì)量。 3.應(yīng)用上述建立的SSH方法構(gòu)建糖尿病腎陰虛證的cDNA消減文庫，消減文庫經(jīng)PCR擴(kuò)增后，采用T/A克隆，應(yīng)用籃白斑系統(tǒng)篩選出陽性克隆(白色)，再經(jīng)反向斑點雜交篩選陽性克隆，然后進(jìn)行測序，再利用http：//www.n

7、cbi.nlm.nih.gov/blast/進(jìn)行序列的同源性分析。 [結(jié)果]1.用TRIzol抽提的總RNA純度高(2.10＞OD260nm/OD280nm＞1.90)，用瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示樣品RNA有清晰的28S和18S條帶，其比值約為2：1，提示樣品RNA沒有明顯的降解，可直接下面實驗。應(yīng)用SMART技術(shù)擴(kuò)增微量RNA，擴(kuò)增產(chǎn)物雙鏈cDNA主要分布在0.5～10kb，呈長瀑布條帶，說明cDNA合成較好。用Chromasp

8、in-1000純化柱純化后，明顯提高了擴(kuò)增產(chǎn)物中的全長基因比例。 2.本實驗獲得的消減雜交產(chǎn)物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，獲得與質(zhì)粒ψX174DNA被HaeⅢ酶切后相似條帶，僅分子量略大一些，這是由于PCR擴(kuò)增的目的產(chǎn)物兩側(cè)帶有部分接頭，提示建立的SSH方法是成功的。而且經(jīng)過MOS后，能夠明顯降低背景，提示MOS對于進(jìn)一步去除假陽性產(chǎn)物是非常必要的。 3.本研究成功地構(gòu)建了糖尿病腎陰虛證cDNA消減文庫，消減產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克

9、隆，應(yīng)用籃白斑系統(tǒng)篩選，正向消減文庫共獲得192個陽性克隆(白色)，反向消減文庫獲得164個陽性克隆(白色)，經(jīng)PCR初步鑒定陽性克隆率高，隨機(jī)挑取48個克隆，應(yīng)用反向斑點雜交進(jìn)一步篩選差異表達(dá)基因，正向消減文庫中初步篩選出8個克隆可能為差異表達(dá)基因，反向消減文庫中初步篩選出5個克隆可能為差異表達(dá)基因。 4.從正向消減文庫中初步篩選出8個克隆，共測序成功7個，1個可能由于雙克隆或其他原因?qū)е聹y序失敗，經(jīng)網(wǎng)上Genbank同源性序

10、列分析，結(jié)果顯示2個表達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetag，EST)為已知基因，1個EST是theNCOA5genefornuclearreceptorcoactivator5，1個EST是Nefattachableprotein，3個EST在染色體上能找到同源性序列，但未發(fā)現(xiàn)同源性基因，2個EST為未找到同源性序列，提示后面這個EST可能為新基因。 5.從反向消減文庫中初步篩選出5個克隆，全部測序成功，經(jīng)網(wǎng)上G