視黃酸促隱睪大鼠生精功能修復(fù)的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：隱睪（cryptorchidism）是兒童時(shí)期最常見的泌尿生殖系統(tǒng)畸形之一，且其發(fā)病率逐年增高，呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)。目前隱睪的治療方案已比較成熟，但仍然存在男性不育等遠(yuǎn)期并發(fā)癥。隱睪導(dǎo)致不育的原因有很多，如睪丸病理損害，生殖細(xì)胞發(fā)育缺陷，精原細(xì)胞增殖分化及減數(shù)分裂發(fā)生障礙等。目前針對(duì)隱睪性不育的治療主要有睪丸器官移植、組織移植、干細(xì)胞移植等方法，然而以上方法均受到倫理學(xué)的限制，使之難以應(yīng)用于臨床。
　　視黃酸（retino

2、ic acid，RA）作為一種雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育和生精功能正常維持所必需的物質(zhì)，對(duì)睪丸的生精微環(huán)境及生精細(xì)胞的發(fā)育和分化發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，但 RA能否作用于隱睪從而恢復(fù)其生精功能的相關(guān)方面研究未見報(bào)道。
　　目的：本研究旨在明確 RA對(duì)隱睪生精細(xì)胞發(fā)育是否具有促進(jìn)作用，并通過對(duì)生精微環(huán)境指標(biāo)的檢測，初步闡明 RA促隱睪生精細(xì)胞發(fā)育的機(jī)制。
　　方法：采用雄激素拮抗劑氟他胺（Flutamide，F(xiàn)lu）誘導(dǎo)建立 SD大鼠隱

3、睪模型，在其生精細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期給予 RA進(jìn)行干預(yù)，觀察各組大鼠睪丸組織的病理變化情況、生精細(xì)胞分化發(fā)育情況及生精微環(huán)境指標(biāo)表達(dá)情況。30只SD孕鼠隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組、Flu隱睪組、RA干預(yù)組，正常對(duì)照組不予任何處理，F(xiàn)lu隱睪組于孕12~20天給予Flu25mg·kg-1·d-1持續(xù)皮下注射，RA干預(yù)組則在Flu隱睪組的基礎(chǔ)上，對(duì)其雄性仔鼠在出生后（postnatal day, PND）第1~10天及28~30天持續(xù)進(jìn)行RA1

4、mg·kg-1·d-1皮下注射。統(tǒng)計(jì)隱睪發(fā)生率，收集對(duì)照組正常睪丸、Flu隱睪組未降睪丸及經(jīng)RA干預(yù)組的隱睪睪丸，稱量睪丸重量，HPLC分析睪丸組織內(nèi)RA含量，同時(shí)進(jìn)行TUNEL細(xì)胞凋亡檢測，HE染色觀察其病理改變，免疫組織化學(xué)、WB、q-PCR檢測增殖分化及減數(shù)分裂關(guān)鍵因子 PLZF、C-kit、Stra8、Scp3及睪丸縫隙連接蛋白Cox43的表達(dá)水平。TEM觀察睪丸緊密連接結(jié)構(gòu)。采集各組成熟大鼠附睪內(nèi)精子，對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)并觀察其形態(tài)

5、學(xué)變化。每組各留15只成熟雄性大鼠進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn)，觀察雌鼠受孕率。
　　結(jié)果：Flu成功誘導(dǎo)出SD大鼠隱睪模型，F(xiàn)lu隱睪組及RA干預(yù)組其隱睪發(fā)生率均較高，二者并無明顯差異，但 RA干預(yù)組睪丸重量、體積、臟器指數(shù)等整體發(fā)育明顯好于Flu隱睪組。Flu隱睪組睪丸內(nèi)RA含量低于正常對(duì)照組，補(bǔ)充RA后睪丸內(nèi)RA含量得到有效恢復(fù)。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)Flu隱睪組睪丸曲細(xì)精管管腔明顯縮窄，管腔間隙變大，各級(jí)生殖細(xì)胞排列紊亂、數(shù)目減少、且發(fā)育遲緩，未

6、見精子細(xì)胞，管腔中央無絮狀精子形成，而正常對(duì)照組及 RA干預(yù)組中可見各層生殖細(xì)胞排列整齊，可見大量精子細(xì)胞及絮狀精子。同時(shí) TUNEL結(jié)果顯示Flu隱睪組生殖細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯高于正常對(duì)照組及RA干預(yù)組。患有隱睪的SD大鼠，其睪丸組織內(nèi)精原細(xì)胞增殖分化指標(biāo)PLZF、C-kit及減數(shù)分裂關(guān)鍵因子Stra8、Scp3表達(dá)明顯下調(diào)，而經(jīng)RA干預(yù)后，其表達(dá)接近正常。隱睪大鼠的支持細(xì)胞間的緊密連接（tight junction，TJ）結(jié)構(gòu)遭到破壞而

7、出現(xiàn)裂隙，縫隙連接蛋白 Cox43表達(dá)水平及位置出現(xiàn)異常，經(jīng)RA處理后，其緊密連接及縫隙連接（gap junction，GJ）情況得到改善。且 RA干預(yù)組的精子數(shù)量（4.60±0.27）×108個(gè)/mL較Flu隱睪組（1.99±0.13）108個(gè)/mL明顯增高而接近正常對(duì)照組（5.53±0.17）×108個(gè)/mL，同時(shí)精子發(fā)生畸形的概率也較隱睪組低。最終的交配實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隱睪大鼠經(jīng) RA干預(yù)后，其使正常雌鼠受孕的幾率由46.7％上升到80