從DNA損傷角度研究增齡過程中大鼠生精功能衰退機制及淫羊藿總黃酮的干預作用.pdf

1、目的：
　　(1)研究增齡過程中大鼠生精功能衰退機制；
　　(2)研究淫羊藿總黃酮(TFE)對自然衰老大鼠生精功能衰退的保護作用，并從調節(jié)DNA損傷角度探討TFE延緩衰老大鼠生精功能衰退的可能作用機制。
　　方法：
　　實驗一：分別取不同年齡階段的SD雄性大鼠，即3月齡、9月齡、15月齡和24月齡，每個年齡階段大鼠各10只，研究不同年齡大鼠生精功能的變化；實驗二：另取10只3月齡SD雄性大鼠作為青年對照組，30只

2、18月齡大鼠隨機分為自然衰老組、TFE低劑量組、TFE高劑量組，每組10只，青年對照組和自然衰老組大鼠灌胃給予質量分數(shù)為1％羧甲基纖維素鈉，TFE低、高劑量組分別灌胃給予10 mg/kg、20 mg/kg的TFE，各組灌胃1次/d，每周灌胃6 d后停藥1 d，持續(xù)給藥6個月后，稱取大鼠體質量，腹腔注射水合氯醛麻醉后處死，研究TFE對衰老大鼠生精功能衰退的干預作用。
　　主要檢測指標如下：(1)快速取出兩側睪丸，稱取兩側睪丸重，計算

3、睪丸指數(shù)；(2) HE染色觀察各組大鼠睪丸組織形態(tài)的變化；(3) ELISA法檢測各組大鼠體內(nèi)睪酮（T）激素水平及各組大鼠睪丸組織中8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的水平；(4)生化法檢測各組大鼠睪丸組織中SOD活性、MDA含量的變化。(5)原位末端標記法（TUNEL法）檢測各組大鼠睪丸生精細胞凋亡情況；(6) Western Blot檢測各組大鼠睪丸組織中衰老相關蛋白p21、凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達，DNA損傷相關蛋白γH

4、2AX、Chk1和p-P53的表達；(7)免疫組化檢測各組大鼠睪丸DNA損傷相關蛋白γH2AX與ATR的表達與定位。
　　結果：
　　實驗一：(1)隨著年齡的增長，大鼠睪丸重和睪丸指數(shù)顯著降低；(2) HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，3、9和15月齡組大鼠睪丸組織生精小管形態(tài)結構完整，管內(nèi)可見排列整齊的各級生精細胞，而24月齡組大鼠睪丸組織生精小管形態(tài)結構發(fā)生明顯變化，生精細胞層數(shù)減少，細胞稀疏，細胞之間的間隙增大，且有部分脫落現(xiàn)象；(3

5、) ELISA法檢測結果顯示，隨著年齡增加，大鼠體內(nèi)T的水平顯著降低，大鼠睪丸組織中8-OHdG的水平顯著升高；(4)生化法檢測發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增加，大鼠睪丸組織中SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高；(5) TUNEL結果顯示，大鼠睪丸內(nèi)發(fā)生凋亡的生精細胞數(shù)隨著年齡增長而明顯增加；(6) Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠睪丸組織中衰老相關蛋白p21、促凋亡蛋白Bax及DNA損傷相關蛋白γH2AX、Chk1、p-P53的表達水平均

6、隨著年齡增加而逐漸上調，抑凋亡蛋白Bcl-2表達水平及Bcl-2/Bax的比值隨著年齡增加而逐漸下調；(7)大鼠睪丸細胞內(nèi)γH2AX和ATR灶點數(shù)量均隨著年齡增加而明顯升高。
　　實驗二：(1) TFE可明顯升高大鼠睪丸重和睪丸指數(shù)；(2) TFE可明顯改善衰老大鼠睪丸生精小管的形態(tài)結構；(3) TFE可顯著升高大鼠體內(nèi)T的水平，顯著降低睪丸組織中8-OHdG的水平。(4) TFE低、高劑量組大鼠睪丸組織中SOD活性顯著升高，MD

7、A含量顯著降低；(5) TFE低、高劑量組大鼠睪丸生精細胞凋亡數(shù)明顯減少。(6) TFE可顯著下調衰老大鼠睪丸組織中p21、Bax、γH2AX、Chk1和p-P53蛋白表達水平，上調Bcl-2蛋白的表達水平及Bcl-2/Bax的比值。(7) TFE可明顯降低大鼠睪丸細胞中γH2AX和ATR灶點數(shù)。
　　結論：
　　(1)增齡過程中雄性大鼠生精功能逐漸減退，其機制可能與睪丸組織中DNA損傷增多，從而誘導生精細胞凋亡有關。