煙堿對AD大鼠認知功能障礙的作用及機制的研究.pdf

1、Alzheimer's病(AD)是神經系統(tǒng)變性疾病，表現為學習、記憶能力下降，智能減退，生活自理能力降低。由于社會老齡化，AD成為老年人繼心臟病、腫瘤和卒中之后的第四位死亡原因。AD患者智能下降，生活自理能力逐漸喪失，在治療和護理上耗費大量的精力和費用，給家庭和社會帶來沉重的經濟壓力。 AD的特征性病理改變是老年斑(SP)、神經原纖維纏結(NFT)、神經元顆?？张葑冃浴⒛X血管淀粉樣變性等。由于AD的確切病因和發(fā)病機制并不完全清楚

2、，因而在臨床缺乏對AD明確有效的治療措施。近年來的研究表明，大腦局部過度的炎性反應引起大量的細胞因子釋放，在AD的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。炎性反應同老年斑和神經原纖維纏結為AD的主要特征。針對AD的病理特點，我們認為阻斷AD的炎性反應是一治療靶點。 β-淀粉樣蛋白(Aβ)可激活小膠質細胞導致炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的分泌增加，小膠質細胞分泌的IL-1β又刺激星形膠質細胞活化，活化的星形膠質細胞進一步分泌炎性

3、細胞因子，加重Aβ的沉積，從而形成“惡性循環(huán)”，導致神經元和突觸的不可逆損害，出現神經病理和臨床改變。 人們開始用非甾體抗炎藥(NSAIDs)治療AD。研究表明，長期應用NSAIDs可以降低AD發(fā)病的危險性并可緩解AD的癥狀。故抗炎治療可以延緩AD的發(fā)生，緩解AD的臨床癥狀。研究證實煙堿可抑制機體的炎性反應。給實驗動物注射煙堿，炎性反應減輕。有學者經過流行病學研究，提出吸煙可降低AD發(fā)病的危險性。給AD患者使用煙堿透皮貼劑，認知

4、功能得到改善。 煙堿在中樞神經系統(tǒng)的受體是膠質細胞、神經元表面的α7nAChR，膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)內分泌炎性介質的主要細胞。我們這項研究的目的是探討在AD大鼠內，煙堿作用于膠質細胞表面的α7nAChR對抗Aβ引起的炎性反應，研究煙堿對AD大鼠認知功能改善的作用機制。 我們給予AD模型大鼠口服煙堿，通過Morris水迷宮實驗，并檢測α7nAChR、IL-1β、IL-6等的變化，觀察煙堿對AD大鼠認知功能的改善作用，探討

5、煙堿的作用機制。在海馬神經組織細胞混合培養(yǎng)體系中加入煙堿和Ap25-35，檢測炎性細胞因子IL-1β、IL-6變化，探討Aβ25-35對神經元的損害作用，煙堿的抗炎效應和對神經細胞的保護作用。 主要研究內容和結果： 1.煙堿對AD大鼠海馬炎性反應的作用 動物實驗分三組，煙堿AD組、AD對照組、正常對照組。給予S-D大鼠口服煙堿，然后在大鼠雙側海馬區(qū)注射Aβ25-35，建立煙堿AD大鼠模型。給S-D大鼠雙側海馬區(qū)注

6、射Aβ25-35，建立AD大鼠模型。 通過Morris水迷宮實驗，檢測煙堿AD組、AD組大鼠和正常對照組大鼠學習記憶能力的變化。煙堿AD組大鼠在平臺定位航行實驗中潛伏期較正常對照組有所延長，在平臺象限的游泳時間百分比和游泳距離百分比較正常對照組降低，但高于AD對照組，差異明顯。AD組大鼠平臺定位航行實驗潛伏期雖有下降趨勢，但不穩(wěn)定，在平臺象限搜索次數較少，目的性不明確，與煙堿AD組、正常對照組相比差異明顯。對三組動物進行方差分析

7、，差異具有顯著意義。 對海馬組織α7nAChR蛋白含量進行檢測，AD組第1天、第7天、第15天α7nAChR蛋白明顯下降，與正常對照組相比，差異顯著。煙堿AD組第1天、第7天、第15天下降，但下降幅度不如AD組明顯，與AD組相比，存在差異；與正常組相比，無差異。 AD組海馬組織IL-1β、IL-6在1-15天明顯升高，第7天達峰值，第15天仍明顯高于正常對照組。煙堿AD組IL-1β、IL-6升高，但與AD組相比，升高幅度

8、不大，存在顯著性差異；與正常對照組相比，存在差異。 α7nAChR.免疫染色陽性細胞：α7nAChR免疫染色陽性物質位于細胞膜和細胞突起。正常對照組α7nAChR免疫陽性物質染色深，陽性細胞排列規(guī)則、密集。煙堿AD組，α7nAChR免疫陽性物質染色較深，陽性細胞排列比較有規(guī)則，接近正常對照組。AD組α7nAChR免疫染色略淺，陽性細胞排列欠規(guī)則。 IB4免疫染色陽性小膠質細胞：IB4免疫染色陽性物質位于整個細胞區(qū)域。正常

9、對照組海馬區(qū)IB4免疫染色陽性細胞數目少、染色淺，胞體扁長，分支細、短；煙堿AD組：海馬區(qū)IB4陽性細胞數較正常組增多，染色淺，胞體形態(tài)與正常組類似；AD組：海馬區(qū)IB4免疫染色陽性細胞數目明顯增多，胞體增大，突起增長增粗，部分IB4陽性細胞呈灌木樣或桿狀。 GFAP免疫染色陽性星形膠質細胞：GFAP免疫染色陽性物質位于整個細胞區(qū)域。正常對照組海馬區(qū)GFAP免疫染色陽性細胞數目少，染色淡而均勻，胞體小，突起細短；煙堿AD組海馬區(qū)

10、GFAP免疫染色陽性細胞數目增多，染色加深，部分細胞胞體增大，突起增長；AD組海馬區(qū)GFAP免疫染色陽性細胞明顯增多，胞體增大，突起增長增粗。 IL-1β免疫染色陽性細胞：IL-1β免疫染色陽性物質主要位于細胞體。正常對照組、煙堿AD組大鼠海馬區(qū)IL-1β免疫染色陽性物質反應弱，染色淺。AD組海馬區(qū)域IL-1β免疫染色陽性增強，陽性細胞增多。 2、煙堿抗Aβ25-35神經毒性作用研究 用2d齡Sprague-Da

11、wley大鼠海馬神經組織細胞混合培養(yǎng)體系。實驗分為：正常對照組、Aβ(2μM)組、煙堿(10μM)+Aβ(2μM)組、煙堿(20μM)+Aβ(2μM)組。 無菌分離海馬組織，培養(yǎng)海馬神經組織細胞混合體系，到第5天，在相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)細胞生長良好，細胞扁平，神經元四周出現明顯光暈，胞體增大，突起長出并逐漸伸長，部分聯(lián)成網絡。分別按10μM、20μM濃度加入煙堿，孵育1h后加入Ap(2μM)，再孵育24小時。檢測細胞培養(yǎng)上清液

12、IL-1β、IL-6含量，測定神經元胞體直徑和突起長度及細胞生存率。 煙堿Aβ組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6含量增高，煙堿濃度10uM時細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6含量與正常對照組相比差異明顯，而煙堿濃度在20uM時細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6含量與正常對照組相比差異不明顯。煙堿Aβ組兩種濃度下，細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6含量與Aβ組相比，差異顯著。 神經元熒光染色，正常對照組神經元胞體

13、飽滿，細胞輪廓圓滑，神經突起形成網絡聯(lián)系；煙堿Aβ組，神經元細胞形態(tài)接近正常，神經元胞體直徑和突起長度與正常組相差不明顯；Aβ組，神經元數目減少，部分細胞脫離底壁而漂浮，損傷神經元逐漸退化、崩解，出現沉淀，神經突起斷裂，神經元胞體直徑增大，胞體腫脹，突起回縮。 煙堿(10μM)+Aβ(2μM)組、煙堿(20μM)+Ap(2μM)組細胞存活率分別為54.7％、62.27％。而Aβ組細胞存活率只有29.57％。煙堿具有抗Aβ神經毒性

14、，提高細胞生存率，保護神經元的作用。 結論: 大鼠口服煙堿后，在其雙側海馬區(qū)注射Aβ25-35，成功建立了煙堿AD大鼠模型。 在Morris水迷宮實驗中，煙堿AD組大鼠平臺定位航行實驗的潛伏期比正常對照組有延長，但比AD大鼠明顯縮短；在空間探索實驗中，煙堿AD組大鼠平臺象限游泳時間百分比、游泳距離百分比較AD組大鼠明顯增高。證實煙堿可改善AD大鼠認知功能。 煙堿AD組與AD組比較，海馬小膠質細胞和星形膠質