HMGB1-TLR2信號通路在術后認知功能障礙和缺血再灌注肺損傷中的作用及其調控機制.pdf

1、第一部分 TOLL樣受體介導的中樞神經炎癥反應在術后認知功能障礙中的作用
　　目的：探討TOLL樣受體介導的腦內神經炎癥反應在無菌性手術創(chuàng)傷引起的術后認知功能障礙中的作用。
　　方法：構建異氟醚麻醉下行頸動脈剝離手術的小鼠手術模型，首先，將CD-1小鼠隨機分為手術組和對照組（n=6），通過蛋白印跡法檢測術后6小時小鼠大腦皮質和海馬組織的總蛋白和膜蛋白中TLR2、TLR4、TLR9的表達情況；其次，將CD-1小鼠隨機分為：對照

2、組、CU-CPT22（TLR1/TLR2抑制劑）組、手術組、手術+CU-CPT22組，CU-CPT22于手術前30分和術后一天分別予腹腔內注射3 mg/kg，通過巴恩斯迷宮和條件相關恐懼實驗測定小鼠術后學習記憶能力的變化（n=15），通過Elisa法檢測術后12小時小鼠大腦皮質和海馬組織內IL-1β、IL-6的表達（n=6）；最后，通過雙染色免疫熒光技術觀察TLR2分別與神經元標記物（NeuN）、星形膠質細胞標記物（GFAP）、小膠質細

3、胞標記物（Iba-1）的定位情況。
　　結果：與對照組比較，右頸動脈剝離術后6小時的大腦皮質和海馬的總蛋白和膜蛋白中TLR2、TLR4表達均明顯增高（P<0.05），而TLR9的總蛋白和膜蛋白表達與對照組比較均無顯著性差異（P>0.05）。與對照組比較，術后12小時大腦皮質和海馬的IL-6表達及大腦海馬的IL-1β表達明顯增高（P<0.05），CU-CPT22處理后能明顯減輕手術創(chuàng)傷誘導的大腦皮質和海馬的IL-1β和IL-6表達。

4、在四天的空間記憶訓練過程中，訓練天數對大鼠找到目標洞的時間有顯著性影響（P<0.05）；在長期記憶測試中，手術組的小鼠找到目標洞的時間較對照組明顯增加（P<0.05），CU-CPT22處理后能明顯縮短手術創(chuàng)傷后小鼠找到目標洞的時間（P<0.05），在短期記憶測試中，有相同的變化趨勢，但是其結果沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。在背景相關恐懼記憶測試中，手術組小鼠的凝固行為時間比對照組明顯減少，CU-CPT22能明顯增加手術創(chuàng)傷后小鼠的凝固

5、行為時間（P<0.05）；在聲音相關恐懼記憶測試中，各個組小鼠的凝固行為時間之間比較沒有顯著性差異（P>0.05）。免疫熒光結果顯示：手術刺激后TLR2在小鼠腦內的表達明顯增多，TLR2的表達位點與NeuN明顯重合，與Iba-1部分重合，與GFAP完成不重合。
　　結論：無菌性手術創(chuàng)傷導致的術后認知功能障礙與腦內TLR2、TLR4激活介導的中樞神經炎性反應有關；手術創(chuàng)傷后腦內TLR2的激活主要來源于神經元細胞和小膠質細胞。

6、　　第二部分腦內HMGB1的激活對TLR2表達的影響及其調控機制研究
　　目的：探討無菌性手術創(chuàng)傷后，腦內HMGB1對TLR2表達的影響以其調控機制。
　　方法：構建異氟醚麻醉下行頸動脈剝離手術的小鼠手術模型，首先，將CD-1小鼠隨機分為手術組和對照組（n=10），通過蛋白印跡法檢測術后6小時小鼠大腦皮質和海馬組織的核蛋白和漿蛋白中HMBG1的表達情況；其次，將CD-1小鼠隨機分為：對照組、Glycyrrhizin（HMGB

7、1抑制劑）組、手術組、手術+Glycyrrhizin組（n=6），Glycyrrhizin于手術前30分腹腔內注射200 mg/kg，通過蛋白印跡法檢測術后6小時小鼠大腦皮質和海馬組織的核蛋白和漿蛋白中HMBG1的表達以及總蛋白和膜蛋白TLR2的表達情況；最后，通過染色質免疫沉淀實驗（ChIP）檢測HMGB1對TLR2啟動子區(qū)域轉錄水平的調控。
　　結果：與對照組比較，右頸動脈剝離術后6小時的大腦皮質和海馬的核蛋白HMGB1表達明

8、顯增高（P<0.05），而漿蛋白HMGB1表達與對照組無顯著性差異（P>0.05），Glycyrrhizin預處理能明顯減輕手術創(chuàng)傷引起的核蛋白HMGB1表達增高（P<0.05）。與對照組比較，術后大腦皮質和海馬的總蛋白和膜蛋白中TLR2表達均明顯增高，Glycyrrhizin預處理能明顯減輕手術創(chuàng)傷引起的TLR2表達增高（P<0.05）。在沉淀富集HMGB1蛋白的DNA片段中，PCR檢測顯示手術組的海馬組織在-283bp~-71 bp

9、啟動子區(qū)域的TLR2 DNA含量比對照組明顯增高（P<0.05）。
　　結論：抑制HMGB1在腦內的表達能有效減少手術創(chuàng)傷后腦內TLR2的激活； HMGB1可通過激活-283bp~-71 bp區(qū)域的TLR2啟動子，促進TLR2的轉錄過程來實現(xiàn)對TLR2的調控作用。
　　第三部分 HMGB1/TLR2信號通路在肺缺血再灌注損傷中的作用
　　目的：探討HMGB1/TLR2信號通路在缺血再灌注肺損傷發(fā)生過程中的作用。

10、　　方法：構建小鼠肺缺血再灌注損傷的動物模型，首先，將BALB/C小鼠隨機分為對照組（Control組）、假手術組（Sham組）和缺血再灌注組（I/R組）組（n=6），收集缺血再灌注側肺組織標本通過HE染色法觀察肺組織損傷情況并評分，通過檢測肺濕干重比評價肺水腫情況，通過蛋白印跡法檢測小鼠肺組織總蛋白TLR2的表達、核蛋白和漿蛋白HMGB1的表達，通過Elisa檢測肺組織IL-1β和IL-6等炎癥因子的表達；其次，將BALB/C小鼠隨機

11、分為對照組（Control組）、Glycyrrhizin（HMGB1抑制劑）組、缺血再灌注組（I/R組）、缺血再灌注+ Glycyrrhizin組（I/R+Gly組），Glycyrrhizin于手術前30分腹腔內注射200 mg/kg，同樣收集缺血再灌注側肺組織標本檢測各組肺組織的肺損傷評分、肺濕干重比、HMGB1和TLR2蛋白的表達、以及炎癥因子IL-1β、IL-6的表達；最后，通過染色質免疫沉淀實驗（ChIP）檢測HMGB1對TLR

12、2啟動子區(qū)域轉錄水平的調控。
　　結果： HE染色后光鏡下觀察顯示：Control組：肺組織未見病理改變，肺泡結構和各級支氣管上皮完整，肺泡間隔正常，無明顯肺間質水腫，無炎性細胞浸潤；Sham組：肺組織未見明顯的病理改變，肺泡結構和各級支氣管上皮大部分完整，肺間隔稍增寬，可見有少量炎性細胞浸潤；I/R組：肺組織損傷明顯，肺泡間隔結構破壞明顯，肺泡內可見明顯水腫及出血，大量炎性細胞侵潤。肺損傷評分分別為：對照組：1.6±0.3；Sh

13、am組：12.4±1.3；I/R組：28.5±2.1。與Control組和Sham組比較，I/R組肺組織的W/D比值顯著升高（P＜0.05），核蛋白和漿蛋白中HMGB1表達、TLR2總蛋白表達均明顯增高（P<0.05）；炎癥因子IL-1β和IL-6的表達亦顯著升高（P<0.05）。Control組和Sham組之間比較，Sham組也能導致肺損傷一定程度的損傷，HMGB1核蛋白、TLR2總蛋白表達明顯增高（P<0.05），但HMGB1漿蛋白

14、無明顯變化（P>0.05）；炎癥因子IL-1β和IL-6的表達亦顯著升高（P<0.05）。與I/R組相比，I/R+Gly組能顯著抑制HMGB1、TLR2總蛋白的表達，抑制炎癥因子IL-1β和IL-6的表達，并減輕缺血再灌注導致肺損傷的程度。Control組和Glycyrrhizin組之間比較各項指標無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。在沉淀富集HMGB1蛋白的DNA片段中，PCR檢測顯示缺血再灌注組的TLR2啟動子區(qū)域的DNA含量與對照組相比