腸道相關(guān)樹突狀細(xì)胞參與創(chuàng)傷性休克腸粘膜屏障功能改變的研究.pdf

1、背景：嚴(yán)重創(chuàng)傷休克常因?yàn)閷?dǎo)致機(jī)體免疫功能抑制，進(jìn)而誘發(fā)全身嚴(yán)重感染、膿毒血癥(sepsis)及多臟器功能衰竭(MOF)。我們的前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重創(chuàng)傷可以改變CD4+T淋巴細(xì)胞的凋亡及分化平衡(Th2反應(yīng))進(jìn)而影響全身的免疫狀態(tài)，然而確切的機(jī)制尚未明確。小腸作為一個(gè)極易受到缺血-再灌注損傷的器官、最大的免疫器官，同時(shí)又接觸最大量的腸腔內(nèi)致病菌，一直以來被認(rèn)為是危重癥患者并發(fā)院內(nèi)感染及MODS的“發(fā)動(dòng)機(jī)”。近年來的研究已經(jīng)聚焦在腸道相關(guān)樹

2、突狀細(xì)胞及腸上皮細(xì)胞上，它們在接受缺血再灌注損傷及腸道致病菌的雙重攻擊下可通過誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的分化異常進(jìn)而導(dǎo)致腸道局部及全身的免疫狀態(tài)處于紊亂狀態(tài)。嚴(yán)重創(chuàng)傷休克打擊下它們將如何工作可能會(huì)成為機(jī)體遭受嚴(yán)重感染的關(guān)鍵機(jī)制。腸系膜淋巴結(jié)樹突狀細(xì)胞及腸粘膜固有層樹突狀細(xì)胞為兩組主要的腸道相關(guān)樹突狀細(xì)胞，它們作為抗原遞呈細(xì)胞“指揮”著腸道局部的免疫反應(yīng)。尤其是作為小腸黏膜第一道免疫屏障的LPDCs一直少有人問津，Satoshi Uematsu首次定

3、義CD11chiCD11bhi的固有層細(xì)胞為小腸LPDCs，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其分別通過獨(dú)特的方式實(shí)現(xiàn)自身活化、對T、B細(xì)胞分化及淋巴細(xì)胞“回巢”的誘導(dǎo)，這些重要的發(fā)現(xiàn)可能成為創(chuàng)傷/腸粘膜免疫研究新的趨勢。另一方面，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)正常腸內(nèi)即有1012個(gè)細(xì)菌和數(shù)倍致死量的內(nèi)毒素。但腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素未能進(jìn)入到循環(huán)中，除了由于機(jī)械與免疫屏障的共同防御外，還由于100-1000倍于需氧菌的厭氧菌占據(jù)鄰近上皮細(xì)胞間空隙，最大可能地防止致病菌與腸上皮的直接接觸，從

4、而發(fā)揮了“生物屏障”的作用。但當(dāng)小腸遭遇I/R損傷尤其是臨床治療使用大量光譜抗生素之后，這些正常保護(hù)機(jī)制被破壞，最終導(dǎo)致腸道發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)及腹瀉，同時(shí)大量條件性腸道致病菌及其毒素的移位促成全身的嚴(yán)重感染。由此我們推測:嚴(yán)重創(chuàng)傷休克一方面通過缺血再灌注損傷等機(jī)制改變腸道相關(guān)樹突狀細(xì)胞的功能進(jìn)而導(dǎo)致腸道免疫防御能力的降低以及全身的免疫狀態(tài)的紊亂;另一方面由于腸道致病菌的大量滋生直接損傷腸粘膜上皮，進(jìn)而加重腸道屏障的損傷。但上述機(jī)制的假說

5、尚需確切的證據(jù)。
　　目的：以腸道相關(guān)樹突狀細(xì)胞以及腸上皮作為腸道免疫屏障的關(guān)鍵細(xì)胞，以創(chuàng)傷休克直接影響樹突狀細(xì)胞的功能以及腸道致病菌致腸粘膜上皮損傷作為兩個(gè)研究思路，深入研究創(chuàng)傷休克后腸道免疫屏障損傷、細(xì)菌移位發(fā)生及機(jī)體遭受嚴(yán)重感染的重要參與機(jī)制。
　　方法：⑴以“長骨骨折+失血休克”為基本內(nèi)容，以平均動(dòng)脈壓30mmHg作為休克標(biāo)準(zhǔn)建立穩(wěn)定的創(chuàng)傷性休克大鼠模型，以腸系膜淋巴結(jié)樹突狀細(xì)胞(MLN-DCs)作為對象，研究其在創(chuàng)

6、傷性休克打擊后的成熟程度、凋亡變化的情況，以及誘導(dǎo)naive CD4+T細(xì)胞向各CD4+T輔助細(xì)胞各亞群（Treg，Th1，Th2）分化能力的改變。⑵在建立創(chuàng)傷性休克小鼠模型及Tlr5-/-小鼠培育的基礎(chǔ)上，以特異性表達(dá)Toll樣受體-5(Tlr5)和特有的非T細(xì)胞依賴免疫激活（視黃醇（RA）介導(dǎo)）信號途徑的腸粘膜下固有層樹突狀細(xì)胞(LPDCs)為關(guān)鍵細(xì)胞，通過對其誘導(dǎo)naiveCD4+T細(xì)胞向Th1及Th17分化、合成分泌視黃醇脫氫酶

7、(RALDH)以及以生物熒光標(biāo)記的檸檬酸桿菌作為標(biāo)記檢測創(chuàng)傷休克后腸道細(xì)菌移位的改變的檢測。⑶在臨床獲得數(shù)株腸源性耐萬古霉素屎腸球菌（VRE），并已證實(shí)其具有較強(qiáng)的致腸上皮損傷的特性，分別種植于caco2模型上，采用電鏡觀察、caco2細(xì)胞層電壓檢測以及TNF-α等細(xì)胞因子的檢測等方法以證實(shí)臨床驗(yàn)證的腸道致病菌直接損傷腸上皮面膜屏障的機(jī)制。
　　結(jié)果：①大鼠MLN-DCs在創(chuàng)傷性休克發(fā)生后的早期即出現(xiàn)成熟度(CD80，CD86，M

8、HCⅡ)下降、凋亡增加，并且誘導(dǎo)na(i)ve CD4+T細(xì)胞向Th2及Treg細(xì)胞分化的趨勢。②創(chuàng)傷性休克可以導(dǎo)致小腸LPDCs合成RA的能力出現(xiàn)明顯下降，由此使得LPDCs誘導(dǎo)Th1及Th17分化下調(diào)。正常情況下Tlr5-KO小鼠小腸LPDCs合成RA及誘導(dǎo)Th1分化的能力較野生型明顯減弱，但創(chuàng)傷休克發(fā)生后變化不明顯。創(chuàng)傷性休克可以導(dǎo)致野生型小鼠小腸內(nèi)細(xì)菌移位明顯增加，但并未導(dǎo)致Tlr5-KO小鼠腸道細(xì)菌向血液及肝臟的移位明顯增加。