桑葉經(jīng)霜前后次生代謝產(chǎn)物表達(dá)差異及機(jī)制初步研究.pdf

1、桑葉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為?？浦参锷orus alba L.的干燥葉，藥用歷史悠久；性寒、味甘苦，歸肺、肝經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱、清肺潤(rùn)燥、清肝明目之功效，常用于風(fēng)熱感冒，肺熱燥咳，頭暈頭痛，目赤昏花等。桑葉采收具有經(jīng)霜采收的特殊要求，但現(xiàn)有的研究結(jié)果對(duì)于桑葉經(jīng)霜采收的合理性與科學(xué)性尚不能科學(xué)闡釋，桑葉經(jīng)霜采收的科學(xué)內(nèi)涵值得深入研究。本論文結(jié)合植物代謝組學(xué)技術(shù)，通過(guò)高效液相色譜法和紫外分光光度法對(duì)桑葉經(jīng)霜前后主要次生代謝產(chǎn)物含量的動(dòng)態(tài)變化

2、及黃酮類成分合成途徑中2個(gè)關(guān)鍵酶活性變化規(guī)律進(jìn)行了分析，并研究了經(jīng)霜前后酶活性的變化與氣候溫度和黃酮類成分積累量之間的相關(guān)性，以期為進(jìn)一步闡明經(jīng)霜對(duì)桑葉黃酮類活性成分影響的機(jī)制及中藥桑葉經(jīng)霜采收的合理性提供一定的理論依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)論如下：
　　1、桑葉經(jīng)霜前后次生代謝產(chǎn)物含量動(dòng)態(tài)變化研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）對(duì)桑葉黃酮類成分進(jìn)行定性分析，并建立高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)分析蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、

3、綠原酸4個(gè)成分的含量，采用紫外分光光度法測(cè)定桑葉總黃酮含量及柱前衍生化-高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定桑葉1-脫氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin，DNJ）含量，研究了不同季節(jié)及經(jīng)霜前后桑葉中4個(gè)黃酮單體成分、總黃酮及生物堿（DNJ）動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。結(jié)果表明，桑葉總黃酮積累量在8月份最低，經(jīng)霜后11月積累量達(dá)到最高值；4個(gè)黃酮單體成分在7、8月份氣溫較高時(shí)含量較低，10、11月份經(jīng)霜后達(dá)最大值；DNJ在7、8月份氣溫較高時(shí)含量最

4、高，9、10月份隨著氣溫下降含量下降，經(jīng)霜后更低。平均氣侯溫度與次生代謝產(chǎn)物含量間的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，溫度與黃酮類成分含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與DNJ含量呈顯著正相關(guān)。
　　2、桑葉經(jīng)霜前后苯丙氨酸解氨酶活性研究?jī)?yōu)化桑葉生合成途徑參與黃酮類物質(zhì)合成的第1個(gè)關(guān)鍵酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性測(cè)定條件，結(jié)果表明，桑葉PAL活性最佳測(cè)定條件為pH8.8(0.05 mol/L)的硼砂-鹽酸緩沖液、加入0.2 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），底物

5、L-苯丙氨酸濃度為0.04 mol/L、40℃水浴反應(yīng)40 min。分析桑葉經(jīng)霜前后PAL活性動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，結(jié)果顯示，桑葉PAL活性在4-5月份較高，之后隨氣溫升高有所下降，到8月份達(dá)到最低，9月份后隨氣溫下降PAL活性逐漸上升。當(dāng)霜降（10月23日）后桑葉PAL活性又明顯增加，到11月5日PAL活性達(dá)到峰值，12月份自然脫落的桑葉未檢測(cè)出PAL活性。
　　3、桑葉經(jīng)霜前后類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶活性研究建立高效液相色譜法分析桑葉生合成途

6、徑參與黃酮類物質(zhì)合成的最后1個(gè)關(guān)鍵酶類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）的活性，研究經(jīng)霜前后桑葉中UFGT活性及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。結(jié)果表明，在4、5月份桑葉UFGT活性較高，之后隨氣溫升高有所下降，9月份達(dá)到最低，經(jīng)霜（10月23日）之后桑葉UFGT活性又明顯增加，到11月25日UFGT活性達(dá)到峰值，12月份自然脫落的桑葉未檢測(cè)出UFGT活性。
　　4、桑葉PAL、UFGT活性與黃酮類成分、氣候溫度的相關(guān)性分析采用SPSS20.0軟件分析桑葉