耐酸天才真菌次生代謝產(chǎn)物的研究及酸調(diào)作用初探.pdf

1、耐酸微生物是可以生存在低pH環(huán)境中的極端微生物,由于其生存環(huán)境的特殊性,其次生代謝產(chǎn)物中可能存在結(jié)構(gòu)新穎且具有生物活性的化學(xué)成分。目前國際上對于耐酸微生物次生代謝產(chǎn)物研究報道較少,該項研究工作前景誘人?！疤觳啪辍笔侵改切┐紊x產(chǎn)量較大,并且能夠產(chǎn)生系列新結(jié)構(gòu)的生物活性菌株。從酸性環(huán)境獲得耐酸天才菌株,相信有望尋找到生物活性物質(zhì)。
　　本文對采自酸性地質(zhì)環(huán)境的云南建水紫陶土壤和錳礦土壤以及河南云臺山國家地質(zhì)公園泥土共27個樣品中

2、分離純化得到121株耐酸真菌。以P388腫瘤細胞增殖抑制、抗甲型流感病毒H1N1活性的測試等作為生物活性篩選模型,以TLC和HPLC指紋圖譜作為化學(xué)篩選模型,采用生物活性測試和化學(xué)多樣性評價集成篩選這樣的方法,最終從耐酸真菌中篩選得到4株耐酸天才真菌,并對其次生代謝產(chǎn)物開展了研究工作。
　　首先通過目標菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化,包括培養(yǎng)基,培養(yǎng)時間等,確定了最佳的發(fā)酵條件。經(jīng)過規(guī)?；l(fā)酵方法分別對4株耐酸天才真菌進行發(fā)酵,以乙酸乙酯對發(fā)

3、酵液進行萃取,獲得發(fā)酵提取物。采用天然產(chǎn)物化學(xué)的研究方法,即采用正相和反相硅膠柱色譜、制備薄層色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜、HPLC(高效液相色譜)等分離純化手段,共分離得到67個化合物,具體為從產(chǎn)紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)JS03-21中分離得到18個化合物(1-17,67);從菌核青霉菌(Penicillium sclerotiorum)ZZ07-5中分離得到19個化合物(18-36

4、);從產(chǎn)紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)ZZ05-4中分離得到17個化合物(37-53);從灰黃青霉菌(Penicillium griseofulvum)ZZ10-35中分離得到13個化合物(54-66)。
　　綜合運用有機質(zhì)譜、核磁共振(1H NMR,13C NMR,DEPT,HMQC,1H-1HCOSY,HMBC,NOESY)、CD(圓二色譜)、紫外光譜、紅外光譜等現(xiàn)代波譜學(xué)技術(shù),以及X-射線單晶衍

5、射、化學(xué)法對化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定,確定了62個化合物結(jié)構(gòu),其中28個為新結(jié)構(gòu)。新化合物結(jié)構(gòu)類型有azaphilone類(1-4,21-27,35),苯并呋喃酮類(6-9),萘醌類(10),倍半萜酯類(14-15),內(nèi)酯類(37-40),脂肪酸(41-42),聚酮類(55-57)。已知化合物的結(jié)構(gòu)類型涉及azaphilone類(18-20,28-29,31-34),倍半萜酯類(16-17),苯的衍生物(11-13,43-46),呋喃衍生物(

6、47-50),色酮(30),萜類(35),內(nèi)酰胺(51-52),蒽醌(58),四氫萘酮類(59-62)等等。運用體外及體內(nèi)生物活性篩選模型,采用MTT法、SRB法等方法評價所獲得的單體化合物的抗腫瘤活性和抗流感病毒H1N1活性;采用瓊脂稀釋法評價化合物對致病菌的抑菌活性?？辜仔虷1N1流感病毒的活性測試表明,化合物2,3,6,11,27對病毒有強效的抑制活性,。IC50分別為61.3、64.0、85.3、58.6、25.5μM,與陽性對

7、照藥利巴韋林相當。對于化合物2還進行了動物體內(nèi)實驗,化合物2可以減輕甲型流感病毒感染引起的小鼠肺部炎癥,對小鼠起到保護作用,體內(nèi)評價有效?？咕鷮嶒灥慕Y(jié)果表明四個倍半萜酯類(14-17)化合物對白色念珠菌均具有中等強度的抑制作用,14、15還對銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌具有中等強度的抑制活性。為探究氨基酸側(cè)鏈在抗真菌活性上的作用,化合物17在水解后得到化合物1α-hydroxyconfertifolin,1α-hydroxyconferti

8、folin經(jīng)測試無抗白色念珠菌活性,證實氨基酸部分對于化合物17的抗白色念珠菌活性是必不可少的。另外,經(jīng)測試化合物9具有弱的抗產(chǎn)氣腸桿菌活性,MIC76.7μM?？鼓[瘤活性測試結(jié)果表明:化合物19-21,23-24對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞A172、U87,一對乳腺癌細胞MCF-7、MCF-7/Adr,骨肉瘤細胞MG-63這5種腫瘤細胞均有中等的抑制活性,IC50在2.6-22.3μM;化合物18對乳腺癌細胞MCF-7有弱的選擇性抑制活性;化合物

9、27對A172、U87、MCF-7、MG-63有中等的抑制活性。化合物57對HL-60細胞增殖有強抑制活性,抑制率達89.1％。
　　最后初步探討了酸調(diào)節(jié)作用對耐酸真菌次生代謝產(chǎn)物的影響。在不同pH,不同酸性培養(yǎng)基條件下對耐酸真菌進行小試發(fā)酵,通過比較菌株次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量、TLC色譜、HPLC-UV指紋圖譜、化合物以及生物活性等,分析酸調(diào)節(jié)作用對耐酸真菌的次生代謝產(chǎn)物化學(xué)多樣性的影響。研究證實了證實了低pH條件能夠增加耐酸真菌代