深海熱液區(qū)非培養(yǎng)微生物基因資源的功能選及研究.pdf

1、深海熱液區(qū)具有高溫、高壓、劇烈化學(xué)梯度和pH梯度等特征，屬于地球上最極端的環(huán)境，其中蘊含著豐富獨特的微生物資源。這些微生物在長期的環(huán)境適應(yīng)過程中形成了自身獨特的代謝機制，可能產(chǎn)生一些比較特殊的次級代謝產(chǎn)物，非常有助于對海洋天然藥物和新穎生物活性分子的開發(fā)利用。
　　 分子生態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，絕大部分的海洋微生物是不可培養(yǎng)的，僅有極少數(shù)的微生物能夠被分離鑒定出來。采用宏基因組學(xué)技術(shù)，能夠獲得自然環(huán)境中所有可培養(yǎng)微生物和不可培養(yǎng)微生物的

2、全部基因。它能夠克服純培養(yǎng)的局限性，有利于深海熱液區(qū)微生物基因資源的研究。
　　 本文對7個宏基因組文庫共計26600個克隆子進行了抗細菌、抗真菌、抗腫瘤等活性篩選。
　　 以枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌作為指示細菌，采用雙層瓊脂平板法從Fosmid文庫4143-1中篩選到5個活性克隆，從Fosmid文庫5-35-17中篩選到7個活性克隆，從Fosmid文庫3-11-8中篩選到3個活性克隆，篩選活性克隆分別占它們各自文庫

3、克隆的0.0635％，0.153%，0.15%。
　　 以釀酒酵母和白色念珠菌作為指示真菌，采用濾紙片瓊脂擴散法對上述15個活性克隆進行抑菌實驗，發(fā)現(xiàn)其中9個克隆子具有抗真菌活性。
　　 以HT1080和BEL7402腫瘤細胞系為篩選模型，采用CCK-8法對上述9個產(chǎn)色素活性克隆子進行篩選，發(fā)現(xiàn)其中3個克隆子具有較好的細胞毒性。
　　 在對文庫進行活性克隆篩選的過程中，意外地發(fā)現(xiàn)一些活性克隆子能夠產(chǎn)生色素。本文選

4、取了其中5個產(chǎn)色素較為穩(wěn)定的活性克隆子進行轉(zhuǎn)座突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座突變使編碼sigma54-依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子或苯酚羥化酶的功能基因失活后，會導(dǎo)致色素缺失現(xiàn)象。
　　 以金黃色葡萄球菌為指示菌，對活性克隆子25D7的色素缺失突變子進行抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)色素缺失突變子的生物活性消失。在文庫克隆篩選中，色素可作為一個初步的篩選標(biāo)記，有利于快速判斷外源基因是否在宿主體內(nèi)獲得表達。
　　 此外，本文還對Fosmid文庫4143-1和C