EPCs與BMSCs復(fù)合細(xì)胞膜片促進(jìn)放療區(qū)種植體骨結(jié)合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【背景與目的】
　　頭面部惡性腫瘤患者，通常需要采用手術(shù)聯(lián)合放療的治療方案。術(shù)后軟硬組織的缺損修復(fù)一直是頜面修復(fù)的難題。種植體技術(shù)的出現(xiàn)，為顱頜面缺損修復(fù)提供了良好的固位和支持，同時(shí)也是修復(fù)牙列缺損或缺失的重要手段。但是，臨床研究證明放療會(huì)明顯降低種植體成功率，破壞種植體周圍骨組織的成骨活性和微循環(huán)。目前，使用高壓氧治療來提高放療區(qū)種植體骨結(jié)合在臨床上已得到應(yīng)用，但其有效性頗具爭(zhēng)議。國(guó)內(nèi)外也有研究者嘗試采用種植體表面處理來解決這一

2、問題，但未形成有效的解決方案。本課題組前期提出了應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stemcells，BMSCs）膜片進(jìn)行種植體表面修飾，體外構(gòu)建組織工程化種植體，利用細(xì)胞膜片促進(jìn)種植體周圍骨組織再生及骨結(jié)合。后期研究發(fā)現(xiàn)單純利用BMSCs很難在放療區(qū)維持成骨持續(xù)性和促進(jìn)微血管再生。目前的研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)能通過參與血管構(gòu)建或旁分泌作用促進(jìn)血管再生，已

3、應(yīng)用于多種組織缺血模型的修復(fù)，在構(gòu)建血管化組織工程骨中也得到了應(yīng)用?；谝陨戏治?，本課題擬采用EPCs和BMSCs構(gòu)建復(fù)合細(xì)胞膜片種植體復(fù)合物，通過研究其體外成骨分化能力和異位成骨能力，以及植入放療動(dòng)物模型后骨結(jié)合形成能力，探討應(yīng)用EPCs和BMSCs復(fù)合細(xì)胞膜片提高放療區(qū)種植體骨結(jié)合的可行性。
　　【方法】
　　1.采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，鑒定其成骨、成脂分化能力和細(xì)胞表型。采用差速貼壁法、密度梯度離心法分

4、離培養(yǎng)大鼠EPCs，檢測(cè)細(xì)胞表型、Weible-Palade小體，鑒定管腔形成、吞噬Dil-Ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1的能力。
　　2.按不同比例對(duì)BMSCs和EPCs進(jìn)行直接共培養(yǎng)，根據(jù)成骨相關(guān)基因及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)量篩選共培養(yǎng)比例。按所選比例培養(yǎng)復(fù)合細(xì)胞膜片。
　　3.細(xì)胞膜片與種植體材料復(fù)合，使用掃描電鏡觀察表面形貌。將細(xì)胞膜片-種植體復(fù)合物成骨誘導(dǎo)5天后，采用堿性磷酸酶、天狼星紅、茜素紅染

5、色、Real-time PCR和Western blot，檢測(cè)其體外成骨活性。
　　4.將細(xì)胞膜片-種植體復(fù)合物移植于裸鼠皮下，8周后取材，采用Micro-CT和硬組織切片染色檢測(cè)復(fù)合細(xì)胞膜片種植體復(fù)合物的異位成骨能力。
　　5.建立大鼠脛骨放療模型，在大鼠脛骨干骺端植入種植體。植入8周后取材，采用Micro-CT和硬組織切片染色觀察復(fù)合細(xì)胞膜片對(duì)骨結(jié)合的影響，取種植體周圍骨質(zhì)進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因及

6、VEGF的表達(dá)。
　　【結(jié)果】
　　1.BMSCs和EPCs符合各自特征。BMSCs具有成骨、成脂分化能力，表面分子CD29、CD90、CD105表達(dá)陽(yáng)性，CD34、CD31表達(dá)陰性。EPCs表面分子CD31、CD144和 VEGFR2表達(dá)陽(yáng)性，胞內(nèi)可見Weible-Palade小體，具有管腔形成、吞噬Dil-Ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1的能力。
　　2.在本實(shí)驗(yàn)選擇的共培養(yǎng)比例中，EPCs與BMSCs按比例

7、為10：1共培養(yǎng)時(shí)成骨相關(guān)基因及VEGF表達(dá)量較高。EPCs與BMSCs共培養(yǎng)并進(jìn)行成膜誘導(dǎo)可形成復(fù)合細(xì)胞膜片。復(fù)合細(xì)胞膜片能貼附并生長(zhǎng)于種植體材料表面。
　　3.BMSCs、EPCs復(fù)合細(xì)胞膜片與種植體復(fù)合后經(jīng)過成骨誘導(dǎo)，茜素紅染色較深，Real-time PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因及VEGF表達(dá)量較高，Western blot檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白表達(dá)較高。
　　4.在異位成骨實(shí)驗(yàn)中，Micro-CT、VG染色顯示復(fù)合細(xì)胞膜片-種

8、植體復(fù)合物周圍有新生骨質(zhì)生成，優(yōu)于其他組。
　　片組種植體周圍骨質(zhì)形成優(yōu)于其他組，種植體周圍骨組織成骨相關(guān)基因及VEGF的表達(dá)量高。
　　【結(jié)論】
　　1.EPCs與BMSCs按比例為10：1共培養(yǎng)，成骨相關(guān)基因及VEGF表達(dá)量較高，可用于構(gòu)建復(fù)合細(xì)胞膜片。
　　2.BMSCs、EPCs復(fù)合細(xì)胞膜片可在種植體表面貼附生長(zhǎng)并具有良好的體內(nèi)、外成骨能力，可用于促進(jìn)種植體周圍成骨。
　　3.BMSCs、EPCs復(fù)