眼表面外胚層上的Smad4在視網(wǎng)膜發(fā)育中的作用研究.pdf

1、目的：
　　眼的形態(tài)形成由間腦兩側(cè)的神經(jīng)上皮向外突出形成視泡開始，突出的視泡遠(yuǎn)端部分接觸其上的表面外胚層，使表面外胚層增厚形成晶狀體板。隨后視泡遠(yuǎn)端和晶狀體板同時(shí)內(nèi)陷生成晶狀體泡和一個(gè)雙層的視杯。在這個(gè)過程中，表面外胚層和視泡相互接觸并相互誘導(dǎo)形成晶狀體和視網(wǎng)膜，這種相互作用在眼的發(fā)育中起著非常重要的作用。針對(duì)這個(gè)誘導(dǎo)過程國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，但是隱藏在晶狀體和視網(wǎng)膜相互作用中的具體分子機(jī)制仍不十分清楚。
　　轉(zhuǎn)化生長

2、因子-β（TGF-β）超家族是一類分泌型的多肽信號(hào)分子，包括TGF-βs、活動(dòng)素(activins)、抑制素(inhibins)、骨形態(tài)形成蛋白(BMPs)等。BMP/TGF-β信號(hào)，結(jié)合不同的BMP/TGFβs受體調(diào)節(jié)表面外胚層的發(fā)育，包括之后的晶狀體、角膜、眼瞼等的發(fā)育。Smad4是BMP/TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子，在脊椎動(dòng)物早期胚胎發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，參與早期胚胎模式形成、后期器官形成和維持組織穩(wěn)態(tài)，包括細(xì)胞增殖、

3、分化、細(xì)胞凋亡及腫瘤形成。Smad4在晶狀體泡和預(yù)定的角膜外胚層以及視泡和眼周基質(zhì)均有表達(dá)，并且在眼的發(fā)育中起著重要的作用。
　　最近研究發(fā)現(xiàn)條件敲除表面外胚層的Smad4可以影響晶狀體的發(fā)育，導(dǎo)致不同程度的小眼畸形和嚴(yán)重的先天性白內(nèi)障。但表面外胚層上的Smad4在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中的作用及其機(jī)制尚不清楚。本研究利用表面外胚層上的Smad4基因條件敲除小鼠，通過觀察其視網(wǎng)膜發(fā)育過程的變化，探討表面外胚層上的Smad4基因表達(dá)缺失對(duì)視

4、網(wǎng)膜發(fā)育的影響。
　　方法：
　　一、構(gòu)建條件敲除小鼠模型
　　運(yùn)用Cre-LoxP技術(shù)建立Smad4基因表面外胚層特異性敲除小鼠模型;PCR確定胚胎及小鼠的基因型，Le-Cre;Smad4flox/flox(Smad4-CKO)小鼠為基因敲除組，Smad4flox/flox小鼠為對(duì)照組。采用GFP熒光和lacZ染色驗(yàn)證Le-Cre表達(dá)的位置。
　　二、觀察Smad4基因條件敲除小鼠眼發(fā)育的變化
　　制備S

5、mad4基因條件敲除小鼠胚胎及生后小鼠眼球的石蠟切片，常規(guī)蘇木素、伊紅染色(HE染色)觀察Smad4基因條件敲除小鼠晶狀體及視網(wǎng)膜發(fā)育形態(tài)的變化，免疫熒光方法觀察Smad4基因條件敲除小鼠晶狀體內(nèi)Smad4表達(dá)的變化。
　　三、BrdU免疫組化分析
　　按照100微克/克體重用量，將BrdU注射到懷孕母鼠或生后小鼠的腹膜腔中，標(biāo)記時(shí)間為1小時(shí)時(shí)處死母鼠或小鼠。免疫熒光方法觀察Smad4基因條件敲除小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)BrdU標(biāo)記細(xì)胞

6、的變化。
　　四、Tunel檢測視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡
　　利用Tunel凋亡試劑盒標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的視網(wǎng)膜細(xì)胞。石蠟切片脫蠟、復(fù)水;Proteinase K37℃消化20min;5ul TdT酶+45ul熒光標(biāo)記液的混合液避光孵育1h; DAPI復(fù)染1min;防淬滅封片劑封片，照相。
　　五、免疫組織化學(xué)方法檢測視網(wǎng)膜細(xì)胞分化情況
　　采用Bm3α、PKCα和GFAP抗體分別標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、雙極細(xì)胞和Mülle

7、r細(xì)胞，觀察Smad4基因敲除小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的分化情況。分別計(jì)數(shù)敲除組和對(duì)照組視網(wǎng)膜上Bm3α+細(xì)胞和PKCα+細(xì)胞來觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和雙極細(xì)胞數(shù)量變化。
　　六、小鼠視網(wǎng)膜基因表達(dá)譜芯片
　　摘取出生當(dāng)天小鼠眼球于DEPC-PBS緩沖液中，沿角膜緣做環(huán)形切口，完整取出視網(wǎng)膜，置于200ul RNA later溶液中，標(biāo)記基因型。將樣本送至上海伯豪生物技術(shù)有限公司做小鼠視網(wǎng)膜基因表達(dá)譜芯片分析。
　　七、實(shí)時(shí)定量P

8、CR定量分析差異表達(dá)基因
　　Trizol法提取敲除組和野生組小鼠視網(wǎng)膜總mRNA，之后將兩組RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照操作說明利用染料法檢測Gli2、Gli3和Wnt2b基因表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。結(jié)果利用公式RQ=2-△△CT的方法進(jìn)行分析。
　　八、原位分子雜交
　　觀察Smad4基因條件敲除小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)Gli2、Gli3和Wnt2b基因的表達(dá)情況。采用PCR法體外合成RNA探針。取小鼠胚胎制取冰凍切

9、片，原位分子雜交觀察Smad4基因條件敲除小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)Gli2、Gli3和Wnt2b基因的表達(dá)情況。
　　九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　獲得的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行獨(dú)立t檢驗(yàn)(independent samplesT-test)，p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、Smad4基因條件敲除小鼠模型的鑒定
　?。ㄒ唬┍狙芯恐?，我們使用Cre-LoxP系統(tǒng)進(jìn)行條件基因打靶，使用Pax6啟動(dòng)子

10、驅(qū)動(dòng)的Cre重組酶，在小鼠胚胎早期將表面外胚層中Smad4基因剔除，并通過PCR鑒定其基因型，Cre PCR片段長度350bp，Smad4突變型PCR片段長度438bp，野生型Smad4 PCR片段長度385bp。其中Le-Cre Smad4flox/flox為實(shí)驗(yàn)組，Smad4flox/flox為對(duì)照組。
　?。ǘ〨FP熒光檢測顯示在Le-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠的晶狀體和角膜上皮有GFP表達(dá)。X-gal染色結(jié)果表明在角膜上皮和晶狀體

11、中LacZ都有表達(dá)，而視網(wǎng)膜上則沒有LacZ的表達(dá)。
　?。ㄈ┟庖邿晒鈾z測Smad4表達(dá)的結(jié)果顯示，在胚胎12.5天，Smad4蛋白在Smad4敲除小鼠晶狀體和角膜上皮表達(dá)缺失，而在視網(wǎng)膜上高表達(dá)，與對(duì)照組無明顯差異。
　　二、條件敲除表面外胚層上的Smad4引起小眼畸形
　　自胚胎12.5天起，和對(duì)照組小鼠相比，Smad4條件敲除小鼠出現(xiàn)不同程度的小眼畸形以及先天性白內(nèi)障，晶體體積明顯小于正常，晶狀體細(xì)胞排列紊亂，

12、內(nèi)有許多空泡，上皮細(xì)胞排列不規(guī)則并向后遷移，分散在晶狀體囊的后部，出生后小鼠晶狀體纖維出現(xiàn)液化壞死。出生7天后，敲除組視網(wǎng)膜上可見視網(wǎng)膜皺褶和視網(wǎng)膜脫離。
　　三、條件敲除表面外胚層上Smad4基因引起視網(wǎng)膜厚度異常
　　在胚胎12.5天到生后第3天，敲除組小鼠視網(wǎng)膜的厚度明顯厚于對(duì)照組，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和神經(jīng)母細(xì)胞層均變厚。P3之后，敲除組視網(wǎng)膜厚度明顯降低并薄于對(duì)照組，各層細(xì)胞均變薄;視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)異常并且排列紊亂，最初神經(jīng)

13、節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞形態(tài)異常，之后視網(wǎng)膜內(nèi)核層細(xì)胞形態(tài)也出現(xiàn)異常;各層視網(wǎng)膜細(xì)胞數(shù)量也明顯減少，至生后1個(gè)月，敲除組小鼠視網(wǎng)膜上幾乎沒有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。
　　四、Smad4基因敲除小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞BrdU標(biāo)記的變化
　　BrdU增殖檢測結(jié)果顯示，胚胎時(shí)期至出生，Smad4敲除小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖數(shù)明顯高于對(duì)照組，出生后BrdU+細(xì)胞逐漸下降并低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　五、Smad4基因敲除小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的變化
　　

14、Tunel凋亡檢測結(jié)果表明，胚胎時(shí)期，敲除組和對(duì)照組視網(wǎng)膜上幾乎無細(xì)胞凋亡，出生之后，對(duì)照組視網(wǎng)膜細(xì)胞由于視網(wǎng)膜組織重構(gòu)作用細(xì)胞凋亡增多，而Smad4基因條件敲除小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡顯著并明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　六、Smad4基因敲除小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的分化情況
　　胚胎時(shí)期，敲除組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量明顯增多并多于對(duì)照組，而出生之后，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量逐漸降低并少于對(duì)照組，至生后1個(gè)月，敲除組小鼠視網(wǎng)膜上幾乎沒有

15、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。小鼠出生后第9天，敲除組小鼠雙極細(xì)胞分化延遲，細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，之后雙極細(xì)胞數(shù)量有所增加，而出生14天后敲除組小鼠雙極細(xì)胞數(shù)量逐漸減少并少于對(duì)照組。另外，至生后1個(gè)月，敲除組視網(wǎng)膜中仍未檢測到Müller細(xì)胞。
　　七、表面外胚層Smad4調(diào)控視網(wǎng)膜發(fā)育的信號(hào)傳導(dǎo)通路篩查
　　表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，找到1897個(gè)表達(dá)顯著差異的基因。我們用SAS在線系統(tǒng)分析這些顯著表達(dá)差異的基因，找到兩個(gè)與視網(wǎng)膜發(fā)育相關(guān)且變化

16、顯著的信號(hào)傳導(dǎo)通路，即Wnt信號(hào)通路和Hh信號(hào)通路。
　　八、實(shí)時(shí)定量PCR檢測表達(dá)差異的基因
　　qPCR結(jié)果顯示，胚胎16.5天時(shí)，敲除組視網(wǎng)膜Wnt2b、Gli2和Gli3表達(dá)上調(diào)，而剛出生和生后9天，Wnt2b、Gli2和Gli3表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　九、原位雜交方法檢測表達(dá)差異的基因
　　原位雜交結(jié)果顯示，在胚胎16.5天時(shí)，Wnt2b基因在敲除組視網(wǎng)膜上表達(dá)明顯上調(diào)，而Gli2和Gli

17、3基因表達(dá)輕度上調(diào);在生后9天，Wnt2b基因在視網(wǎng)膜上表達(dá)量很低，而Gli2和Gli3基因在敲除組視網(wǎng)膜上表達(dá)量明顯少于對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　　1.采用了Cre-LoxP系統(tǒng)進(jìn)行條件基因打靶能夠在小鼠胚胎早期將表面外胚層中Smad4基因條件性地剔除，而其他組織中Smad4表達(dá)正常。
　　2.表面外胚層Smad4基因敲除后晶狀體發(fā)育的障礙，Smad4條件敲除小鼠出現(xiàn)不同程度的小眼畸形和嚴(yán)重的先天性白內(nèi)障。
　　

18、3.表面外胚層Smad4基因敲除引起視網(wǎng)膜皺褶和視網(wǎng)膜脫離。
　　4.表面外胚層上的Smad4基因敲除會(huì)引起視網(wǎng)膜厚度的變化，在胚胎時(shí)期視網(wǎng)膜厚度增厚，而在出生之后視網(wǎng)膜厚度變薄，可能是由于在胚胎時(shí)期視網(wǎng)膜細(xì)胞過多地增殖而出生之后視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡過度引起的。
　　5.表面外胚層上的Smad4基因敲除會(huì)引起視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞分化延遲以及Müller細(xì)胞分化失敗。
　　6.晶狀體可能通過釋放某種信號(hào)調(diào)控視網(wǎng)膜上的Hh和Wnt信號(hào)