條件敲除小鼠Smad4基因?qū)Y(jié)膜杯狀細(xì)胞發(fā)育的影響.pdf

1、目的:Smad4基因在眼發(fā)育過程中具有重要作用，其缺失或突變會(huì)造成嚴(yán)重的眼發(fā)育缺陷。已有研究表明條件性敲除小鼠表面外胚層上的Smad4基因會(huì)引起嚴(yán)重的小眼畸形，先天性白內(nèi)障，視網(wǎng)膜發(fā)育缺陷和淚腺發(fā)育不良等。Smad4基因的缺失也會(huì)影響小鼠眼表的正常發(fā)育，使胚胎期小鼠眼瞼閉合失敗，出現(xiàn)出生時(shí)眼瞼開放畸形。正常的結(jié)膜組織中存在大量的杯狀細(xì)胞，杯狀細(xì)胞質(zhì)和量的異常與許多眼表疾病密切相關(guān)。杯狀細(xì)胞的正常發(fā)育涉及多條信號(hào)通路，其中TGF-β超家族

2、的信號(hào)通路也涉及其中。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Cre-LoxP系統(tǒng)條件敲除小鼠表面外胚層的Smad4基因，探討Smad4基因在結(jié)膜杯狀細(xì)胞發(fā)育過程中的作用。
　　研究方法:本研究通過PCR的方法選取基因型為L(zhǎng)e-Cre Smad4flox/flox（Smad4-cKO）的小鼠為實(shí)驗(yàn)組，同窩同齡的Smad4flox/flox(Control)小鼠為對(duì)照組。分別選取P0，P7，P9-P14，P16，P18，P20和1M這11個(gè)天數(shù)的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究

3、。通過HE染色觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠眼發(fā)育情況。使用AB-PAS染色觀察結(jié)膜杯狀細(xì)胞的發(fā)育情況。使用Tunel法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠角結(jié)膜細(xì)胞的凋亡情況。通過Real-time PCR實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠P8和P20兩個(gè)天數(shù)的結(jié)膜組織中，與杯狀細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的的Spdef和Foxa3基因的表達(dá)情況，結(jié)果用公式RQ=2-△△CT進(jìn)行計(jì)算與分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用spss2.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:通過HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，

4、Smad4基因的缺失嚴(yán)重影響小鼠的眼發(fā)育，實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)出生時(shí)眼瞼開放畸形，嚴(yán)重的晶狀體空泡和視網(wǎng)膜與晶狀體粘連。對(duì)照組的野生型小鼠在出生時(shí)上下眼瞼呈閉合狀態(tài)，直到P13上下眼瞼分離。通過AB-PAS染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的野生型小鼠在P9出現(xiàn)結(jié)膜杯狀細(xì)胞，但細(xì)胞數(shù)量少，體積小。隨著天數(shù)的增加，結(jié)膜杯狀細(xì)胞的數(shù)量逐漸增多，至P13睜眼后結(jié)膜杯狀細(xì)胞體積增大，至P20基本達(dá)到成熟水平。條件敲除Smad4基因后的實(shí)驗(yàn)組小鼠在P12才發(fā)現(xiàn)結(jié)膜杯狀細(xì)

5、胞，且其數(shù)量明顯少于同窩同齡的對(duì)照組小鼠。P12-1M期間的實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞無(wú)明顯增加趨勢(shì)，且數(shù)量皆明顯少于同窩同齡的對(duì)照組小鼠。通過Tunel法檢測(cè)到，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠P14和P20兩天角膜和結(jié)膜細(xì)胞的凋亡明顯增多，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠結(jié)膜組織相比，P8和P20兩天實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)膜組織中Spdef和Foxa3轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量明顯下調(diào)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論: