嗜酸性粒細(xì)胞在AERD患者PGD2產(chǎn)生中的作用及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、阿司匹林耐受不良呼吸道疾病(Aspirin-exacerbated respiratory disease，AERD)以哮喘、鼻息肉及阿司匹林不耐受為特點(diǎn)，即患者服用或吸入阿司匹林或其它非選擇性環(huán)氧合酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）抑制劑后出現(xiàn)急性呼吸系統(tǒng)反應(yīng)，又稱(chēng)Samter's三聯(lián)征。國(guó)外的研究表明，該病大約占成人哮喘的7％，但占了重度哮喘的14％，我國(guó)關(guān)于該病的報(bào)道較少，但近年來(lái)，隨著阿司匹林在我國(guó)的廣泛應(yīng)用

2、，AERD的發(fā)病率和檢出率正在不斷增高。
　　AERD是公認(rèn)的難治性鼻竇炎的一種，目前尚無(wú)有效的治療方法，患者通常經(jīng)過(guò)多次鼻內(nèi)鏡鼻竇手術(shù)，但扔不能阻止鼻息肉復(fù)發(fā)，需要長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素以控制哮喘等癥狀，部分患者在接觸阿司匹林后甚至出現(xiàn)危及生命的哮喘。在阿司匹林高敏反應(yīng)的過(guò)程中，包括半胱氨酸白三烯(Cysteinyl leukotrienes，CysLTs)、類(lèi)胰蛋白酶、ECP、前列腺素D2(Prostaglandin D2，PGD

3、2)在內(nèi)的多種介質(zhì)釋放增多，而5-LO(Lipoxygenase，LO)-LTC4酶通路代謝異常，產(chǎn)生過(guò)量的CysLTs而誘發(fā)氣管收縮、分泌增加及嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophil，EOS)浸潤(rùn)被認(rèn)為是AERD的主要病理機(jī)制，但這并不能解釋所有的現(xiàn)象，特別是在阿司匹林脫敏治療過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)一部分患者無(wú)法耐受脫敏治療，而這部分患者血液中的PGD2含量顯著高于耐受治療者，并且這種PGD2的增高與患者氣道阻塞的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，進(jìn)一步提示了

4、PGD2在AERD發(fā)病中的重要作用。
　　作為花生四烯酸經(jīng)COX代謝途徑的重要產(chǎn)物，PGD2可以引起氣管痙攣，血管擴(kuò)張，EOS浸潤(rùn)，樹(shù)突狀細(xì)胞活化和遷移等多種作用，在AERD的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，AERD患者血液中PGD2及其代謝產(chǎn)物含量顯著高于阿司匹林耐受性哮喘(Aspirin tolerant asthma，ATA)患者，而且在AERD患者服用阿司匹林后會(huì)進(jìn)一步升高，但關(guān)于PGD2來(lái)源的問(wèn)題卻存在較大爭(zhēng)議，傳

5、統(tǒng)的觀念一直認(rèn)為肥大細(xì)胞是PGD2的主要來(lái)源，因?yàn)榇龠M(jìn)PGD2生成的前列腺素合成酶(hematopoietic prostaglandin D2 synthase，hPGDS)，過(guò)去僅在肥大細(xì)胞中被檢測(cè)到。但近年來(lái)隨著抗體特異性、敏感性的提高及檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，某些EOS中也檢測(cè)到了hPGDS的表達(dá)，但關(guān)于AERD患者的EOS是否能表達(dá)hPGDS并進(jìn)一步合成釋放具有生物活性的PGD2及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制等問(wèn)題，至今仍無(wú)相關(guān)研究。
　　目

6、的：
　　通過(guò)對(duì)AERD患者鼻息肉及外周血EOS合成、釋放PGD2及其相關(guān)機(jī)制的研究，明確EOS在AERD患者PGD2釋放中的作用及相關(guān)調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步揭示AERD的病理生理過(guò)程及發(fā)病機(jī)制，并為該病的靶向干預(yù)提供理論基礎(chǔ)。
　　方法和結(jié)果：
　　1、鼻息肉及鼻竇粘膜中hPGDS在mRNA水平的差異表達(dá)
　　hPGDS是PGD2合成的限速酶，可以促進(jìn)PGH2向PGD2轉(zhuǎn)化，我們通過(guò)qPCR對(duì)9例AERD、17例CH

7、ES患者的鼻息肉及9例對(duì)照組鼻竇粘膜hPGDS在mRNA水平的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示AERD患者鼻息肉中hPGDS在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)要顯著高于其它兩組(p＜0.05)。
　　2、鼻息肉及鼻竇粘膜的hPGDS免疫熒光染色
　　為了明確鼻息肉及鼻竇粘膜組織中hPGDS在蛋白水平的表達(dá)及其細(xì)胞來(lái)源，我們對(duì)AERD、慢性增生性嗜酸性粒細(xì)胞性鼻竇炎(Chronic hyperplasticeosinophilic sinusitis，

8、CHES)的鼻息肉及對(duì)照組鼻竇粘膜進(jìn)行了hPGDS的免疫熒光染色。結(jié)果顯示對(duì)照組鼻竇粘膜中幾乎沒(méi)有hPGDS陽(yáng)性染色;CHES鼻息肉中檢測(cè)到了中等程度表達(dá)的hPGDS陽(yáng)性染色;而高強(qiáng)度的hPGDS染色幾乎都出現(xiàn)在了AERD患者的鼻息肉中。且陽(yáng)性細(xì)胞絕大多數(shù)來(lái)源于雙葉核的EOS。
　　我們進(jìn)一步分析并計(jì)算了陽(yáng)性EOS占總EOS的比例，顯示AERD組顯著高于CHES(p＜0.05)及對(duì)照組(p＜0.05)，表明AERD患者的單個(gè)EOS

9、有更強(qiáng)的hPGDS表達(dá)能力;而計(jì)算陽(yáng)性EOS占總陽(yáng)性細(xì)胞的比例顯示AERD組顯著高于CHES(p＜0.05)及對(duì)照組(p＜0.01)，這表明AERD中的EOS對(duì)于陽(yáng)性染色的貢獻(xiàn)顯著高于其它兩組，反映了EOS在AERD患者h(yuǎn)PGDS表達(dá)中發(fā)揮了更為重要的作用，是hPGDS的重要甚至是主要來(lái)源。
　　3、外周血純化嗜酸性粒細(xì)胞hPGDS的表達(dá)
　　前期的實(shí)驗(yàn)中我們成功證實(shí)了AERD患者的鼻息肉在mRNA及蛋白水平均高表達(dá)hPGD

10、S，并且免疫熒光的結(jié)果顯示這種高表達(dá)較多的來(lái)源于EOS，因此我們進(jìn)一步分離純化了人外周血EOS，并對(duì)其hPGDS表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示AERD患者外周血純化EOS的hPGDS在mRNA水平的表達(dá)要顯著高于哮喘組及對(duì)照組(p＜0.05); Western Blot法檢測(cè)的結(jié)果表明AERD患者純化EOS的hPGDS在蛋白水平的表達(dá)量要顯著高于對(duì)照組(p=0.01)及哮喘組患、者(p＜0.05)。這直接證明了AERD患者EOS

11、在mRNA及蛋白水平均具有更強(qiáng)的hPGDS合成能力，同時(shí)也表明了除去組織內(nèi)的高表達(dá)外，AERD患者外周血EOS的hPGDS也是高表達(dá)的。
　　4、嗜酸性粒細(xì)胞PGD2釋放的檢測(cè)及阿司匹林刺激實(shí)驗(yàn)
　　前面的研究證實(shí)了EOS在mRNA和蛋白水平可以成功的表達(dá)hPGDS，并且AERD患者的EOS是高表達(dá)的，表明其具備了PGD2的合成能力，但這種高表達(dá)并不一定意味著EOS可以合成并釋放具有生物活性的PGD2。因此，為了驗(yàn)證EOS是

12、否能合成并釋放PGD2，我們通過(guò)EIA法直接測(cè)定了純化EOS釋放的PGD2。并進(jìn)一步檢測(cè)了LysASA刺激對(duì)PGD2釋放量的影響。結(jié)果顯示，所有EOS均檢測(cè)到了PGD2釋放，同時(shí)，隨著LysASA的刺激濃度增加，PGD2的釋放量也逐步增加，表明了LysASA可以促進(jìn)EOS釋放PGD2。進(jìn)一步的分析表明，無(wú)論是在刺激前還是刺激后，AERD組的EOS，其上清液PGD2含量均高于哮喘組及對(duì)照組。
　　5、IFN-γ對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)hP

13、GDS及合成PGD2影響的研究
　　上面的研究表明AERD患者的EOS高表達(dá)hPGDS并具有更強(qiáng)的PGD2分泌能力，為了進(jìn)一步研究其高表達(dá)hPGDS及釋放PGD2的機(jī)制。我們首先通過(guò)IFN-γ、IL5、IL4、IL13刺激純化的健康人外周血EOS，然后通過(guò)qPCR檢測(cè)其hPGDS表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示各種因子刺激前后，hPGDS的表達(dá)沒(méi)有顯著的變化，表明細(xì)胞因子對(duì)已經(jīng)分化成熟的EOS調(diào)節(jié)能力較弱。
　　我們進(jìn)一步將研究的重點(diǎn)

14、轉(zhuǎn)向由CD34+造血干細(xì)胞分化成熟的EOS，在IFN-γ及非IFN-γ環(huán)境中將健康人純化CD34+造血干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的EOS，進(jìn)一步通過(guò)qPCR檢測(cè)成熟后EOS的hPGDS的表達(dá)，結(jié)果顯示IFN-γ環(huán)境中成熟的EOS的hPGDS表達(dá)顯著升高。而進(jìn)一步通過(guò)EIA檢測(cè)其上清液中PGD2的含量，顯示IFN-γ組上清液中PGD2的含量顯著高于非IFN-γ組，并且在LysASA刺激后顯示了更強(qiáng)的PGD2釋放能力。
　　結(jié)論：
　

15、　1.AERD患者鼻息肉中hPGDS在mRNA及蛋白水平高表達(dá)，AERD患者鼻息肉嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)了更高的hPGDS，并且相比肥大細(xì)胞，這種表達(dá)更加廣泛，嗜酸性粒細(xì)胞在其中起了更為重要的作用。
　　2.AERD外周血純化的嗜酸性粒細(xì)胞高表達(dá)hPGDS，并且可以進(jìn)一步合成釋放PGD2。
　　3.阿司匹林能夠刺激嗜酸性粒細(xì)胞釋放PGD2，AERD患者的嗜酸性粒細(xì)胞能夠釋放更多PGD2，并且對(duì)阿司匹林的刺激更敏感，這可能是AERD