基于蛋白組學(xué)技術(shù)松屬素對(duì)柑橘青霉的抑菌機(jī)理研究.pdf

1、黃酮化合物具有多樣的生理活性和潛在的藥用價(jià)值，其中C5-OH和C7-OH是重要的抗菌活性基團(tuán)，研究表明，松屬素能顯著抑制意大利青霉呼吸作用并誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡，已有呼吸抑制試驗(yàn)證明線粒體呼吸電子傳遞鏈酶復(fù)合物Ⅰ，Ⅳ和Ⅴ活性會(huì)直接被松屬素抑制;松屬素抑制青霉的關(guān)鍵部位，可能處于線粒體呼吸鏈上，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙，誘發(fā)細(xì)胞凋亡或程序性壞死。本文以柑橘青霉病的主要病原菌意大利青霉為指示菌，使用被證明抗菌活性最強(qiáng)的5，7二羥基黃酮類化合物

2、松屬素，借助蛋白組學(xué)IRAQ技術(shù)，來(lái)研究松屬素不同時(shí)間處理后，引起的意大利青霉蛋白表達(dá)差異，以及通過(guò)分子模擬作為參考，呼吸鏈復(fù)合物作為靶點(diǎn)的可能機(jī)制，及松屬素引起程序性死亡的探究。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.松屬素處理后，意大利青霉的氧化磷酸化通路、TCA循環(huán)產(chǎn)生多種1.2倍以上表達(dá)差異的蛋白，其中線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ，Ⅳ和Ⅴ，及呼吸相關(guān)酶琥珀酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶產(chǎn)生顯著差異，導(dǎo)致導(dǎo)致菌體能量代謝紊亂;程序性死亡過(guò)

3、程中某些指示蛋白，比如Apoptosis-inducing factor、凋亡BAX inhibitor蛋白、肽酰脯氨基順反異構(gòu)化的酶(CYPA)等表達(dá)產(chǎn)生顯著變化;另外，應(yīng)激狀態(tài)下誘導(dǎo)表達(dá)的伴侶蛋白HSP70，其在維持蛋白質(zhì)構(gòu)象上具有多種作用，經(jīng)過(guò)松屬素處理后，產(chǎn)生了1.4倍以上的異常表達(dá)。
　　2.通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件MOE，對(duì)呼吸鏈蛋白同源建模，然后通過(guò)與松屬素分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，探究酶復(fù)合物與松屬素對(duì)接的可能性，以此作為呼吸鏈

4、酶復(fù)合物作為靶蛋白的佐證。經(jīng)過(guò)同源建模與分子對(duì)接后，發(fā)現(xiàn)具有與松屬素結(jié)合的可能性蛋白全部集中在線粒體呼吸鏈蛋白復(fù)合物Ⅰ和蛋白復(fù)合物Ⅴ，其中得分最高的Unigene2720_CK_0A屬于復(fù)合物Ⅴ，松屬素與受體Unigene2720_CK_0A結(jié)合腔形成多個(gè)氫鍵相互作用，A環(huán)5位羥基和結(jié)合腔88位Tyr殘基形成氫鍵;C環(huán)羰基與82位Ala殘基形成氫鍵;除此之外，參與配體相互作用的殘基還包括78位Glu、77位Glu、73位Pro、75位S

5、er、74位Lys、79位Ala、81位Leu、80位Asn、96位Glu、95Val、97位GLy、98位Gln、25位Val等。
　　3.利用MRM技術(shù)對(duì)目標(biāo)蛋白的進(jìn)行特異性選擇，驗(yàn)證差異蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，鑒定出的復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ中的多個(gè)肽段，在表達(dá)趨勢(shì)上與原ITRAQ結(jié)果一致，在表達(dá)量的差異上表現(xiàn)更為顯著;采用qPCR驗(yàn)證目標(biāo)蛋白是否在轉(zhuǎn)錄水平存在差異，結(jié)果表明復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ在mRNA的表達(dá)水平與蛋白最終表

6、達(dá)情況上并不一致，僅有Unigene2707_CK_0A、Unigene14205_CK_0A（復(fù)合物Ⅴ）是在mRNA表達(dá)差異與蛋白表達(dá)差異上完全一致。
　　4.使用Z-VAD-FMK和Necrostatin-1結(jié)合依文思藍(lán)染色判斷細(xì)胞程序性死亡方式，其中Z-VAD-FMK是一種pan-caspase抑制劑（泛硫胱胺酸蛋白酶抑制劑），Necrostatin-1是RIP1特異性的抑制劑，結(jié)果顯示通過(guò)抑制pan-caspase，沒有產(chǎn)