人角膜緣微環(huán)境細(xì)胞(LNC)對兔角膜緣干細(xì)胞缺乏(LSCD)治療效果的動物實驗研究.pdf

1、目的：研究人角膜緣微環(huán)境細(xì)胞（limbal niche cells, LNC）對兔堿燒傷角膜緣干細(xì)胞缺乏（limbal stem cell deficiency, LSCD）的治療效果。
　　方法：⑴采用眼庫來源人角膜緣組織，膠原酶A消化分離LNC， DF-12培養(yǎng)基、Matrigel包被塑料培養(yǎng)板，體外培養(yǎng)人LNC，傳代4-6代細(xì)胞用于研究。⑵從人的角膜緣組織中分離培養(yǎng)人角膜緣微環(huán)境細(xì)胞(LNC)，以人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（B

2、one marrow-derived mesenchymal stem cells，BMMSC）為對照，采用流式細(xì)胞技術(shù)和熒光定量實時PCR技術(shù)檢測其CD90，CD105，CD73及SCF（stem cell factor,干細(xì)胞因子）等干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)情況。⑶用1mol/L氫氧化鈉溶液堿燒傷兔角膜，建立兔角膜緣干細(xì)胞缺乏模型。⑷采用活體熒光標(biāo)記法標(biāo)記人角膜緣微環(huán)境細(xì)胞（LNC）和人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSC)，進行結(jié)膜下注射移

3、植。⑸將30只兔隨機分為空白對照組、BMMSC組、LNC組3組，每組10只，觀察角膜情況的變化，采用裂隙燈顯微鏡眼前段照相、角膜熒光素鈉染色、角結(jié)膜印記細(xì)胞學(xué)檢查評價LSCD嚴(yán)重程度。
　　結(jié)果：①成功分離和培養(yǎng)LNC。②流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示：96.73％的LNC表達(dá)CD90，88.71%的LNC表達(dá)CD105，95.02%的LNC表達(dá)CD73，11.06%的LNC表達(dá)SCF；而98.61%的BMMSC表達(dá)CD90，92.31%的

4、BMMSC表達(dá)CD105，98.09%的BMMSC表達(dá)CD73，3.14%的BMMSC表達(dá) SCF。熒光定量實時PCR結(jié)果從mRNA水平顯示：LNC和BMMSC細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CD90,CD73,CD105和SCF的含量無明顯差別（P>0.05），而LNC細(xì)胞中vimentin,SOX2和POU5F的mRNA含量明顯高于BMMSC細(xì)胞（P<0.05）。③堿燒傷后可見兔角膜混濁、上皮缺損、新生血管長入、印跡細(xì)胞學(xué)顯示 PAS(+)，成功建立兔角

5、膜緣干細(xì)胞缺乏模型。④熒光標(biāo)記結(jié)果顯示結(jié)膜下移植的LNC和BMMSC在移植后4周有向角膜遷移的趨勢。(5)30只兔中有12只完成3個月實驗，分別為空白對照組3只、BMMSC組5只、LNC組4只，在此基礎(chǔ)上進行分析：通過角膜混濁程度、角膜熒光素鈉染色評分的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示BMMSC與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）、LNC組與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）、BMMSC組與LNC組比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；通過角