高基質(zhì)金屬蛋白酶-9大鼠心室重構(gòu)模型的建立及評(píng)價(jià).pdf

1、研究背景：
　　心室重構(gòu)(ventricular remodeling)是指心室由于心肌損傷或者負(fù)荷增加，導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)、功能及表型的變化所產(chǎn)生的形狀、大小、組織結(jié)構(gòu)和室壁厚度等一系列變化，心室重構(gòu)包括細(xì)胞重構(gòu)（即心肌細(xì)胞本身結(jié)構(gòu)、代謝及功能異常改變）和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellarmatrix, ECM）重構(gòu)（主要是膠原合成和降解之間動(dòng)態(tài)平衡的破壞，促使膠原沉積或降解）。心室重構(gòu)主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、成纖維細(xì)胞增殖、心肌細(xì)

2、胞內(nèi)成分改變和ECM基質(zhì)膠原的堆積引起的心肌纖維化。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)是一組可以特異地降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的Zn2+依賴的酶家族，心肌中的MMPs能夠分解心臟中的基質(zhì)成分，是心室重構(gòu)中基質(zhì)降解的重要推動(dòng)力量。MMP-9是MMPs的一種，又稱為明膠酶B，在心室肌中含量豐富，過去研究發(fā)現(xiàn)，多種心室重構(gòu)疾病狀態(tài)伴有心肌MMP-9水平的增高，例如，心肌梗死、擴(kuò)張型心肌病、心肌

3、炎等疾病狀態(tài)下常常伴有心肌中MMP-9水平的增高；通過調(diào)節(jié)MMP-9水平或進(jìn)行疾病的治療降低MMP-9可使心室重構(gòu)發(fā)生改變。因此，高M(jìn)MP-9與心室重構(gòu)可能有密切的關(guān)系，但是心肌中MMP-9水平的增高如何影響心室重構(gòu)，具體機(jī)制尚不清楚。良好的高M(jìn)MP-9心室重構(gòu)動(dòng)物模型對(duì)該類疾病心室重構(gòu)的機(jī)制和防治研究具有重要的意義。然而，迄今為止，大多數(shù)高M(jìn)MP-9模型是某種疾病的心室重構(gòu)模型，其高M(jìn)MP-9狀態(tài)是一種伴隨狀態(tài)還是病因尚不確定。為了更

4、好地研究MMP-9在心室重構(gòu)中的作用，一個(gè)明確的由高M(jìn)MP-9導(dǎo)致的心室重構(gòu)模型十分必要。鑒于我們前期研究發(fā)現(xiàn)給予外源性MMP-9可以引起大鼠心室重構(gòu)，本研究擬在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討輸入外源性MMP-9來構(gòu)建高M(jìn)MP-9心室重構(gòu)大鼠模型的方法，為高M(jìn)MP-9心室重構(gòu)的研究提供一種方便、價(jià)廉的工具。
　　目的：
　　探討輸入外源性MMP-9構(gòu)建高M(jìn)MP-9心室重構(gòu)大鼠模型的方法，為高M(jìn)MP-9心室重構(gòu)的研究提供一種方便、價(jià)廉的工

5、具。
　　方法：
　　將48只SPF級(jí)健康8周齡雄性wistar大鼠（體重160～200g），按體重分層隨機(jī)分4組，每組各12只。對(duì)照組（生理鹽水2ml）；模型組：MMP-9低劑量組（重組大鼠MMP-9，0.7ng/體重（g），2ml）；MMP-9中劑量組（重組大鼠MMP-9，1.4ng/體重（g），2ml）；MMP-9高劑量組（重組大鼠MMP-9，2.1ng/體重（g），2ml），腹腔注射，每周2次，連續(xù)注射至第4周末，隨

6、機(jī)抽取每組中的6只大鼠，結(jié)束實(shí)驗(yàn)，作為第一階段組（n=24）；各組剩余的6只大鼠繼續(xù)注射至第8周末，結(jié)束實(shí)驗(yàn)，作為第二階段組（n=24）。
　　1.實(shí)驗(yàn)前1天、第一階段組的實(shí)驗(yàn)第28天以及第二階段組的第56天予無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓計(jì)進(jìn)行血壓測量。兩階段組分別在測量血壓后予心臟彩超檢查大鼠的左室大體結(jié)構(gòu)【左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、舒張末期容積（LVEDV）、收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、收縮末期容積（LVESV）?！亢妥笫夜δ堋径梯S縮

7、短率(LVFS)、心排血量（CO）、每搏輸出量（SV）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、二尖瓣血流E峰、A峰的比值（E/A）、心率（HR）】。
　　2.用ELISA法檢測血清MMP-9水平；分離左室稱重并計(jì)算左室重量指數(shù)（LVWI=左室重量mg/體重g）；左室心肌組織切片行HE（蘇木素-伊紅）染色觀察光鏡下心肌細(xì)胞及間質(zhì)的變化；VG（苦味酸-酸性品紅）染色觀察心肌間質(zhì)膠原分布。圖像分析法測定心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）；免疫印跡法（wes

8、tern blotting）檢測心肌中MMP-9水平；RT-PCR法檢測心肌中MMP-9mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠一般情況及存活率
　　模型組與對(duì)照組大鼠比較，精神狀態(tài)、進(jìn)食量、活動(dòng)量、體重增長程度均無明顯異常。模型組及對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間均存活,存活率為100％。
　　2.各組大鼠的基線水平
　　各組大鼠的初始平均體重水平未見明顯差異，實(shí)驗(yàn)前1天測量的各組大鼠的血壓基線水平均無明顯差異

9、。
　　3.心肌組織MMP-9蛋白水平的改變
　　第一階段:與對(duì)照組相比，高劑量組心肌MMP-9水平顯著增高（p＜0.05）；低、中劑量組心肌MMP-9水平均有增高趨勢(shì)（p＞0.05）。模型組內(nèi)比較，高劑量組心肌MMP-9水平明顯高于低劑量組（p＜0.05）。
　　第二階段：與對(duì)照組相比，中、高劑量組心肌MMP-9水平均顯著增高（P<0.05），低劑量組心肌MMP-9水平有增高趨勢(shì)（p＞0.05）。模型組內(nèi)比較，高劑量

10、組心肌MMP-9水平明顯高于低劑量組（p＜0.05）。
　　4.血清中MMP-9蛋白水平的改變
　　第一階段：與對(duì)照組相比，中、高劑量組血清MMP-9水平均顯著增高(p＜0.05)，低劑量組血清MMP-9水平有增高趨勢(shì)(p＞0.05)。模型組內(nèi)比較，高劑量組血清MMP-9水平明顯高于低劑量組(p＜0.05)。
　　第二階段：與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組血清MMP-9水平均顯著增高(p＜0.05)。模型組內(nèi)比較，高劑量

11、組血清MMP-9水平明顯高于低劑量組(p＜0.05)。
　　5.心肌組織MMP-9mRNA的表達(dá)
　　第一階段：與對(duì)照組相比，除低劑量組外，中、高劑量組心肌MMP-9mRNA表達(dá)均顯著增高(p＜0.05)，模型組內(nèi)比較，差異不明顯(p＞0.05)。
　　第二階段：與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組心肌MMP-9mRNA表達(dá)水平均無明顯變化(p＞0.05)，模型組內(nèi)比較，差異不明顯(p＞0.05)。
　　6.心室重構(gòu)的

12、改變
　　6.1.左室重量指數(shù)的改變
　　第一階段：與對(duì)照組相比，高劑量組LVWI顯著增高(p＜0.05)。低、中劑量組LVWI均增高趨勢(shì)(p＞0.05)。模型組內(nèi)比較，高劑量組LVWI明顯高于低劑量組(p＜0.05)。
　　第二階段：與對(duì)照組相比，高劑量組LVWI顯著增高(p＜0.05)。低、中劑量組LVWI均增高趨勢(shì)(p＞0.05)。模型組內(nèi)比較，高劑量組LVWI明顯高于低劑量組(p＜0.05)。
　　6.2

13、.心臟大體結(jié)構(gòu)與功能的改變
　　第一階段：心臟超聲發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組心臟結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)均未達(dá)到顯著差異(p＜0.05)。
　　第二階段：心臟超聲發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，中、高劑量組LVEDV和LVIDd顯著增大（p<0.05），低劑量組LVEDV和LVIDd有增大趨勢(shì)(p＞0.05)。模型組內(nèi)比較，高劑量組LVEDV和LVIDd均顯著大于低劑量組(p＜0.05)；各組結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)的其他指標(biāo)未見明顯差異。

14、>　　6.3.心肌組織病理形態(tài)學(xué)的改變
　　1）形態(tài)學(xué)改變(HE染色)：第一階段:與對(duì)照組相比，中、高劑量組大鼠心肌細(xì)胞明顯肥大、排列紊亂，部分心肌纖維斷裂，胞漿溶解壞死。低劑量組心肌細(xì)胞與對(duì)照組相比，無明顯改變。第二階段：與對(duì)照組相比，模型組大鼠均可見心肌纖維斷裂、缺損、肌溶解，心肌細(xì)胞消失。
　　2）心肌間質(zhì)膠原變化(VG染色)：第一階段：與對(duì)照組相比，高劑量組心肌間質(zhì)CVF顯著降低(p＜0.05)，低、中劑量組CVF均

15、有降低趨勢(shì)(p＞0.05)。模型組內(nèi)比較，差異不明顯(p＞0.05)。第二階段：與對(duì)照組相比，中、高劑量組心肌間質(zhì)CVF均顯著降低(p＜0.05)，低劑量組CVF有降低趨勢(shì)(p＞0.05)。模型組內(nèi)比較，高劑量組較低劑量組CVF顯著下降(p＜0.05)。
　　7.血壓的改變
　　第一階段：與對(duì)照組相比，高劑量組收縮壓及舒張壓水平均顯著增高(p<0.05)，低、中劑量組收縮壓及舒張壓水平均有上升趨勢(shì)(p>0.05)。
　

16、　第二階段：與對(duì)照組相比，除低劑量組外，中、高劑量組收縮壓及舒張壓水平均顯著增高(p<0.05)。模型組內(nèi)比較，高劑量組較低劑量組收縮壓及舒張壓水平顯著增高(p<0.05)。
　　8.制作高M(jìn)MP-9心室重構(gòu)模型的成功率
　　以對(duì)照組的水平作為標(biāo)準(zhǔn)，心肌組織MMP-9蛋白水平≥均數(shù)＋2倍標(biāo)準(zhǔn)差、LVEDV≥均數(shù)＋2倍標(biāo)準(zhǔn)差、CVF≤均數(shù)-2倍標(biāo)準(zhǔn)差作為標(biāo)準(zhǔn)。第二階段高劑量模型組構(gòu)建高M(jìn)MP-9心室重構(gòu)模型的成功率最高，達(dá)到8