基于AGEs-RAGE加味桃核承氣湯防治T2DM大血管病變大鼠的實驗研究.pdf

1、文獻研究:
　　隨著經(jīng)濟的發(fā)展、環(huán)境的改變、人們工作節(jié)奏的加快、生活方式的改變以及人口老齡化的加速，糖尿病(diabetes mellitus，DM)已成為影響人類健康最重要的慢性非傳染性疾病。在眾多DM并發(fā)癥中，DM大血管病變，包括冠狀動脈、腦動脈、下肢動脈病變，是DM最主要的致死致殘并發(fā)癥。研究指出，DM患者患上大血管病變的風(fēng)險比非DM患者增加2-4倍，75％的DM患者最終死于DM大血管病變誘發(fā)的心腦血管事件。動脈粥樣硬化(a

2、therosclerosis，AS)是DM大血管病變的主要病理表現(xiàn)，早期發(fā)現(xiàn)AS，并使用相應(yīng)藥物進行干預(yù)，對延緩AS進展、改善患者預(yù)后、降低心腦血管終點事件十分重要。然而，目前西醫(yī)學(xué)對于早期篩查AS尚缺乏敏感性和特異性高的檢驗學(xué)指標(biāo)，在藥物治療方面亦存在消化道出血、橫紋肌溶解等副作用，因此亟需尋找一種更安全、更高效的藥物以用于臨床。
　　目前認為晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycationend products，AG

3、Es)的過多生成，AGEs-RAGE途徑的激活是DM大血管病變的重要發(fā)病機制，許多實驗與臨床研究證實AGEs水平與DM大血管病變具有顯著相關(guān)性，但目前仍缺乏相應(yīng)的循證證據(jù)支持。
　　中醫(yī)學(xué)雖無DM大血管病變之統(tǒng)稱，但可散見于“胸痹”、“真心痛”、“眩暈”、“暈厥”、“中風(fēng)”、“癡呆”、“偏枯”、“痹癥”、“脫疽”、“痰飲”、“瘀血”“厥證”等病名，古今醫(yī)家數(shù)千年以來對治療此類疾病積累了豐富的經(jīng)驗。熊曼琪教授是廣州中醫(yī)藥大學(xué)首席教授

4、，基于消渴病“氣陰兩虛，瘀熱互結(jié)”的病機，熊教授在《傷寒論》桃核承氣湯基礎(chǔ)上開發(fā)出加味桃核承氣湯以用于臨床，并取得良好療效。前期研究已發(fā)現(xiàn)，加味桃核承氣湯具有降糖、調(diào)脂、改善胰島素抵抗、保護胰島β細胞，改善眾多DM并發(fā)癥的作用。朱章志教授認為，DM大血管病變臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，其背后的病機隨著疾病的進展而變化，大多數(shù)患者病機還具有“少陰陽虛”、“陽失健運”的特點，并據(jù)此對熊教授原創(chuàng)加味桃核承氣湯作出了相應(yīng)的配伍加減。為進一步研究各組方對防

5、治DM大血管病變的可能機制，優(yōu)化加味桃核承氣湯的組方配伍，本研究以AGEs-RAGE途徑、氧化應(yīng)激為研究切入點，借助動物實驗，運用多種現(xiàn)代科學(xué)手段加以評估，以期進一步發(fā)掘加味桃核承氣湯的臨床效能。
　　循證研究:
　　目的:
　　AGEs的生成過多，AGEs-RAGE途徑的激活是DM大血管病變的重要發(fā)病機制，已有多個研究發(fā)現(xiàn)DM大血管病變患者的血清AGEs水平與單純DM患者（指未發(fā)現(xiàn)DM并發(fā)癥的患者）、健康人群相比存在

6、顯著差異，但至今尚未有循證醫(yī)學(xué)上的證據(jù)。因此，本研究擬采用Meta分析的方法，根據(jù)初定的納入排除標(biāo)準(zhǔn)，檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻，并對納入文獻的數(shù)據(jù)進行合并分析，以探討AGEs與DM大血管病變的相關(guān)性，從而為AGEs未來的臨床應(yīng)用提供一定的循證支持。
　　方法:
　　根據(jù)初定的納入排除標(biāo)準(zhǔn)，以“晚期糖基化終末產(chǎn)物”、“糖尿病大血管病變”、“冠心病”、“腦卒中”、“糖尿病足”、“下肢動脈病變”、“動脈粥樣硬化”、“AGEs”、、“co

7、ronary heart disease”、“diabetic macroangiopathy”、“atherosclerosis”、“diabetic foot”、“cerebral apoplexy”檢索國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫關(guān)于AGEs與DM大血管病變、單純DM患者以及健康人群的文獻，篩選出要納入的文獻后，從中提取文獻的一般特征及相關(guān)納入指標(biāo)，并使用RevMan5.3統(tǒng)計軟件對納入指標(biāo)進行Meta分析。最后根據(jù)Meta分析的結(jié)果對AGEs與

8、DM大血管病變的相關(guān)性進行分析推理，對其中存在異質(zhì)性的部分使用敏感性分析等手段處理，并借助漏斗圖對文獻進行發(fā)表偏倚評估。
　　結(jié)果:
　　共納入14個研究，1290例患者，其中DM大血管病變患者338例，單純DM患者607例，健康人群345例，Meta分析結(jié)果表明，AGEs-CML方面，DM大血管病變患者較單純DM患者、健康人群顯著升高（P＜0.01），且經(jīng)過敏感性分析后結(jié)果穩(wěn)定;AGEs方面，DM大血管病變患者較健康人群顯

9、著升高（P＜0.01），DM大血管病變患者經(jīng)敏感性分析后較單純DM患者顯著升高（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　以AGEs-CML為代表，DM大血管病變患者血清AGEs-CML水平較單純DM患者、健康人的存在顯著差異，其機制可能為DM大血管病變患者AGEs生成過多，激活A(yù)GE-RAGE途徑，引起下游一系列通路的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，從而破壞血管內(nèi)皮細胞，影響血管內(nèi)皮功能，促進AS的進展，最終發(fā)展為DM大血管病變。本次Meta

10、分析從循證醫(yī)學(xué)角度印證了AGEs在DM大血管病變中具有一定的特異性升高，但受研究質(zhì)量、異質(zhì)性的影響，AGEs要成為一種特異性、敏感性指標(biāo)用于DM大血管病變診斷、評估仍有待進一步大樣本、高質(zhì)量、多中心的臨床研究、實驗研究加以證實。
　　實驗研究:
　　目的:
　　立足朱章志教授對DM大血管病變的診療經(jīng)驗，對熊曼琪教授原創(chuàng)加味桃核承氣湯進行配伍加減，進一步加減變化為中藥2組（原創(chuàng)方改生大黃為熟大黃，倍芒硝）、中藥3組（原創(chuàng)

11、方入細辛，倍桂枝）。基于AGEs-RAGE途徑及其下游的氧化應(yīng)激通路，通過與中藥1組（原創(chuàng)方）、西藥組（氨基胍）作對比，借助動物實驗、HE染色、QRT-PCR、IHC、電子顯微鏡、Western blotting、ELISA等現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段，以探討加味桃核承氣湯防治T2DM大血管病變的可能作用機制，以期發(fā)掘加味桃核承氣湯防治T2DM大血管病變的更優(yōu)配伍組方及作用潛能，從而為臨床應(yīng)用提供一定的實驗證據(jù)。
　　方法:
　　120只

12、雄性SD大鼠經(jīng)普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法隨機抽出10只大鼠作為正常組，該組繼續(xù)使用普通飼料喂養(yǎng)，余下110只大鼠作為造模組改用高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周。6周后進行預(yù)實驗，預(yù)實驗后確定STZ40mg/kg為造模劑量，隔日對剩余89只大鼠按40 mg/kg的劑量腹腔注射STZ造模，正常組則腹腔注射等量檸檬酸緩沖液，兩次FPG穩(wěn)定在11.1mmol/L以上確立為T2DM成模大鼠，最后共成模74只。將成模大鼠按FPG水平分層，然后按分

13、層情況進一步隨機分為5組，其中模型組14只，中藥1組15只、中藥2組15只、中藥3組15只，西藥組15只。實施藥物干預(yù)共8周。實驗期間觀察大鼠的一般情況，每隔4周測大鼠體重、攝食量、攝水量及尾尖FPG，實驗結(jié)束時使用ELISA法檢測FINS，計算Homa-IR;全自動生化分析儀檢測HbA1c、TC、TG、HDL-C、LDL-C、SOD、CAT、GSH-Px等血糖血脂、氧化應(yīng)激指標(biāo);ELISA法測胸主動脈AGEs的含量，光鏡、電鏡觀察胸主

14、動脈病理形態(tài)，IHC法觀察胸主動脈AGEs的染色情況，Western blotting法檢測各組大鼠胸主動脈ERK1/2蛋白的表達、RTQ-PCR法檢測各組大鼠胸主動脈RAGE mRNA、eNOS mRNA、p47phox mRNA的表達。
　　結(jié)果:
　　1、一般情況:正常組在實驗全過程保持精神狀況良好，皮膚嫩滑，毛色光亮，體重平穩(wěn)上升，尿量、糞便量正常，無多飲、多食。模型組大鼠則出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿、消瘦等癥狀，精神

15、差，反應(yīng)緩慢，毛發(fā)干枯，皮膚干燥，糞便量偏少偏硬。藥物干預(yù)后，各藥物干預(yù)組大鼠的精神情況、體征、體重、口干多飲等癥狀較模型組都得到不同程度的改善，但仍較正常組差。最終大鼠共死亡11只，其中模型組死亡4只，中藥1組死亡3只，中藥2組死亡2只，中藥3組死亡1只，西藥組死亡1只。死亡原因主要考慮糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病高滲性昏迷、灌胃失誤導(dǎo)致肺部感染等急性并發(fā)癥。實驗結(jié)束共71只大鼠完成實驗，其中正常組10只，模型組10只，中藥1組11只，中

16、藥2組12只，中藥3組14只，西藥組14只。體重、攝水量、攝食量方面，正常組體重隨著時間遷移平穩(wěn)增加，攝水量、攝食量則無明顯變化;模型組體重則逐漸下降，攝水量、攝食量逐步增加;分析時間因素、干預(yù)因素、時間因素與干預(yù)因素的交互作用，各藥物干預(yù)組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;藥物干預(yù)8周后，各藥物干預(yù)組在增加體重、降低攝水量、降低攝食量方面均顯著優(yōu)于模型組（P＜0.01），但較正常組仍較差（P＜0.01），其中中藥3組在增加體重、降

17、低攝水量方面顯著優(yōu)于其余藥物干預(yù)組（P＜0.01），在攝食量改善方面與其他藥物干預(yù)組相當(dāng)（P＞0.05），中藥1組、中藥2組在減少攝水量方面顯著優(yōu)于西藥組(P＜0.01)。
　　2、糖脂代謝及胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，藥物干預(yù)8周后，各藥物干預(yù)組在FPG、HbA1c方面均顯著低于模型組(P＜0.01)，但仍顯著高于正常組（P＜0.01)，中藥1組、中藥2組、西藥組較中藥3組顯著升高（P＜0.01）。

18、脂代謝方面，藥物干預(yù)8周后，各中藥干預(yù)組在TC、TG、LDL-C、HDL-C均無組間差異;TC、TG、LDL-C方面，各中藥干預(yù)組較模型組TC顯著降低（P＜0.01），西藥組較模型組則無明顯差異（P＞0.05）;HDL-C方面，各中藥干預(yù)組較模型組顯著升高（P＜0.01），西藥組較模型組無明顯差異（P＞0.05）。IR方面，各藥物干預(yù)組均較模型組顯著降低（P＜0.01），較正常組顯著增加(P＜0.01)，各藥物干預(yù)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

19、P＞0.05）。
　　3、AGEs-RAGE途徑，各造模組在藥物干預(yù)8周后AGEs濃度較正常組顯著增多(P＜0.01)，其中模型組增幅最多（P＜0.01），中藥1組較中藥2組無明顯差別(P＞0.05)，西藥組、中藥3組較中藥1組、中藥2組顯著減少（P＜0.01），中藥3組較西藥組無明顯差異（P＞0.05），免疫組化IOD值方面與胸主動脈AGEs ELISA檢測含量結(jié)果變化一致，圖像顯示，AGEs在各組大鼠胸主動脈中呈棕黃色顆粒沉淀

20、，其中，正常組可見散在稀疏棕黃色顆粒沉淀，染色較淺;模型組則在內(nèi)皮層、平滑肌層、血管壁間質(zhì)均可見大量棕黃色顆粒沉淀，染色極深;各藥物干預(yù)組棕黃色沉淀染色較模型組淺，但較正常組深;中藥3組、西藥組較中藥1組、中藥2組、染色淺，其中中藥3組棕黃色顆粒主要沉淀在內(nèi)皮層，平滑肌層僅見稀疏、淺染棕黃色顆粒;中藥1組、中藥2組、西藥組內(nèi)皮層、平滑肌層均可見深染棕黃色顆粒沉淀，其中中藥1組、中藥2組較西藥組棕黃色顆粒沉淀增多。RAGE mRNA方面，

21、各藥物干預(yù)組較模型組顯著減少（P＜0.01），中藥1組較中藥2組無明顯差別（P＞0.05），西藥組較中藥1組顯著減少(P＜0.01)，中藥2組、中藥3組較西藥組無明顯差別（P＞0.05）。
　　4、氧化應(yīng)激:各組在SOD、CAT、GSH-Px中的變化趨勢，組間比較大致相同。正常組較各造模組顯著升高（P＜0.01），各藥物干預(yù)組較模型組顯著升高（P＜0.01），中藥3組較中藥1組、中藥2組、西藥組顯著升高（P＜0.01），中藥1組、

22、中藥2組較西藥組無明顯差異（P＞0.05）。p47phox mRNA方面，各造模組在干預(yù)8周后仍較正常組顯著升高（P＜0.01），中藥1組較模型組降低（P＜0.05），中藥2組、中藥3組、西藥組較模型組顯著降低（P＜0.01），中藥3組較中藥1組、中藥2組、西藥組顯著降低（P＜0.01）。
　　5、內(nèi)皮功能:在eNOS mRNA表達上，正常組較各造模組顯著升高（P＜0.01），模型組較各藥物干預(yù)組顯著降低（P＜0.01），中藥3組

23、較中藥1組、中藥2組、西藥組顯著升高（P＜0.01），中藥1組、中藥2組較西藥組無明顯差異（P＞0.05）。在ERK1、ERK2表達上，各組組間比較及變化趨勢相近，western blotting檢測結(jié)果顯示，正常組較各造模組顯著降低(P(0.01)，各藥物干預(yù)組較模型組顯著降低(P＜0.01)，中藥1組、中藥2組、中藥3組較西藥組顯著降低(P＜0.01)，中藥1組、中藥2組較中藥3組無明顯差異（P＞0.05）。
　　6、胸主動脈

24、病理形態(tài):HE染色方面，正常組顯示內(nèi)皮層各細胞鏈接緊密，無脫落，無腫脹變性，無泡沫細胞形成，平滑肌層亦鏈接緊密，無異常增殖。模型組顯示內(nèi)皮層細胞脫落嚴(yán)重，細胞腫脹明顯，可見泡沫細胞、巨噬細胞，平滑肌層結(jié)構(gòu)紊亂，平滑肌細胞明顯增殖，在內(nèi)皮層可見纖維帽形成;中藥1組、中藥2組、中藥3組、西藥組病變情況較模型組減輕;中藥1組顯示內(nèi)皮細胞脫落、腫脹，內(nèi)皮層可見少量脂質(zhì)沉積，少量泡沫細胞形成，平滑肌層細胞鏈接紊亂，可見細胞異常增殖，但未見纖維帽形

25、成;中藥2組顯示內(nèi)皮細胞稍腫脹，病變程度較中藥1組稍減輕，未見明顯泡沫細胞、纖維帽形成，平滑肌層可見細胞異常增殖，細胞鏈接不規(guī)律;中藥3組顯示內(nèi)皮層細胞輕微腫脹，但各細胞間鏈接尚密切，未見明顯泡沫細胞、纖維帽形成，病變程度較中藥1組、中藥2組、西藥組減輕，平滑肌層亦未見明顯異常增殖;西藥組顯示內(nèi)皮層細胞稍腫脹，可見少量泡沫細胞形成，未見纖維帽形成，平滑肌細胞排列紊亂、松散。電鏡結(jié)果顯示，正常組胸主動脈各內(nèi)皮細胞鏈接緊密，內(nèi)皮細胞緊貼內(nèi)皮

26、下層，細胞膜完整光滑，細胞內(nèi)各結(jié)構(gòu)正常;模型組內(nèi)皮細胞壞死并脫落，呈空泡樣，細胞內(nèi)各結(jié)構(gòu)消失溶解;中藥1組顯示內(nèi)皮細胞變性損傷，細胞膜破壞，細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)模糊，并與內(nèi)皮下層形成間隙;中藥2組顯示內(nèi)皮細胞細胞膜損傷，但仍能清楚看到細胞核;中藥3組顯示內(nèi)皮細胞水腫、損傷，損傷程度較中藥1組、中藥2組、西藥組輕，細胞內(nèi)各細胞器尚清晰;西藥組顯示內(nèi)皮細胞細胞膜變性損傷較嚴(yán)重，細胞內(nèi)各細胞器不清晰，但較模型組損傷程度輕。
　　結(jié)論:
　　

27、在改善一般情況方面，加味桃核承氣湯能夠有效降低減少T2DM大血管病變大鼠攝水量、攝食量，并有效增加大鼠體重;血糖方面，加味桃核承氣湯能夠通過改善胰島素抵抗、降低FPG、HbA1c起到平穩(wěn)降糖的效果;血脂方面，加味桃核承氣湯能通過降低TG、TC、LDL-C，升高HDL-C起到改善脂質(zhì)代謝的效果;在保護大血管病變方面，加味桃核承氣湯能夠通過AGEs-RAGE途徑，降低AGEs生成，降低受體RAGE mRNA的表達，從而抑制AGEs-RAGE

28、系統(tǒng)，并通過增加血清SOD、CAT、GSH-Px水平，降低p47phox mRNA表達，修復(fù)機體抗氧化應(yīng)激能力，最后通過增加eNOS mRNA，減少ERK1/2蛋白表達，起到改善內(nèi)皮功能、減少血管平滑肌細胞異常增殖、延緩動脈粥樣硬化進展的效果。此外，本次實驗亦發(fā)現(xiàn)西藥氨基胍雖能有效降低AGEs生成，但其延緩AS的作用較弱，說明DM大血管病變的機制仍然是多靶點的，今后仍需要大樣本、多中心的實驗研究進一步證實。另一方面，組間比較結(jié)果顯示，中

29、藥3組相較于中藥1組、中藥2組、西藥組能夠更有效抑制AGEs-RAGE通路、修復(fù)抗氧化應(yīng)激能力、更有效地延緩AS的進展，究其深入的中醫(yī)學(xué)理論，中藥3組較其余兩組主要加強了“溫運陽氣”的作用，體現(xiàn)了DM大血管病變的病機除氣陰不足、瘀熱互結(jié)外，還具有陽失健運的特點，這提示了今后中醫(yī)藥在治療DM大血管病變過程中除注重既往的益氣養(yǎng)陰、活血化瘀外，還應(yīng)重視“溫運陽氣”，這為中醫(yī)藥防治DM大血管病變奠定了重要的理論基礎(chǔ)，有待今后臨床與實驗研究進一步